Microscopie de traction intégrée à la microfluidique pour la migration collective chimiotaxique
Summary
La migration collective des cellules dans le développement, la cicatrisation des plaies et la métastes du cancer est souvent guidée par les gradients des facteurs de croissance ou des molécules de signalisation. Décrit ici est un système expérimental combinant la microscopie de traction avec un système microfluidique et une démonstration de la façon de quantifier la mécanique de la migration collective sous gradient biochimique.
Abstract
Les cellules modifient les schémas de migration en réponse aux stimuli chimiques, y compris les gradients des stimuli. La migration cellulaire dans la direction d’un gradient chimique, connu sous le nom de chimiotaxis, joue un rôle important dans le développement, la réponse immunitaire, la cicatrisation des plaies et les métastes cancéreuses. Alors que la chimiotaxie module la migration des cellules individuelles ainsi que des collections de cellules in vivo, la recherche in vitro se concentre sur la chimiotaxie unicellulaire, en partie en raison de l’absence des outils expérimentaux appropriés. Pour combler cette lacune, décrit ici est un système expérimental unique qui combine microfluidique et micropatterning pour démontrer les effets des gradients chimiques sur la migration cellulaire collective. En outre, la microscopie de traction et la microscopie de contrainte de monocouche sont incorporées dans le système pour caractériser des changements dans la force cellulaire sur le substrat aussi bien qu’entre les cellules voisines. Comme preuve de concept, la migration des îles circulaires micropatternées des cellules canines de madin-Darby (MDCK) est testée sous un gradient de facteur de croissance d’hépatocyte (HGF), un facteur de diffusion connu. On constate que les cellules situées près de la concentration plus élevée de HGF migrent plus rapidement que celles du côté opposé à l’intérieur d’une île cellulaire. Dans la même île, la traction cellulaire est similaire des deux côtés, mais le stress intercellulaire est beaucoup plus faible sur le côté de la concentration plus élevée de HGF. Ce nouveau système expérimental peut offrir de nouvelles possibilités d’étudier la mécanique de la migration chimiotaxique par les collectifs cellulaires.
Introduction
La migration cellulaire dans les systèmes biologiques est un phénomène fondamental impliqué dans la formation des tissus, la réponse immunitaire, et la cicatrisation des plaies1,2,3. La migration cellulaire est également un processus important dans certaines maladies comme le cancer4. Les cellules migrent souvent en groupe plutôt qu’individuellement, ce qui est connu sous le nom de migration cellulaire collective4,5. Pour que les cellules se déplacent collectivement, la détection du microenvironnement est essentielle6. Par exemple, les cellules perçoivent les stimuli physicochimiques et réagissent en changeant la motilité, les interactions cellule-substrat et les interactions cellule-cellule, entraînant une migration directionnelle le long d’un gradient chimique7,8, 9,10. Sur la base de cette connexion, des progrès rapides ont été réalisés dans les technologies de laboratoire sur puce qui peuvent créer des microenvironnements chimiques bien contrôlés tels que le gradient d’un chimioattractant11,12,13 . Alors que ces microfluidiques à base de laboratoire sur puce ont déjà été utilisés pour étudier la chimiotaxie de l’ensemble cellulaire ou sphéroïdes cellulaires14,15,16,17, ils ont été utilisés principalement dans le contexte de la migration unicellulaire18,19,20,21. Mécanismes sous-jacents à une réponse collective cellulaire à un gradient chimique n’est toujours pas bien compris14,22,23,24,25,26 . Ainsi, le développement d’une plate-forme qui permet le contrôle spatiotemporel des facteurs solubles ainsi que l’observation in situ de la biophysique des cellules aidera à démêler les mécanismes derrière la migration cellulaire collective.
Développé et décrit ici est un système microfluidique multicanal qui permet la génération d’un gradient de concentration de facteurs solubles qui module la migration des amas de cellules à motifs. Dans cette étude, le facteur de croissance des hépatocytes (HGF) est choisi pour réguler le comportement migratoire des cellules canines de madin-Darby (MDCK). HGF est connu pour atténuer l’intégrité cellulaire et améliorer la motilité des cellules27,28. Dans le système microfluidique, Fourier transforme la microscopie de traction et la microscopie de contrainte de monocouche sont également incorporées, qui permet d’analyser la motilité, la force contractile, et la tension intercellulaire induite par les cellules constituantes en réponse à un HGF inclinaison. Dans la même île, les cellules situées près de la concentration plus élevée de HGF migrent plus rapidement et montrent des niveaux de stress intercellulaire plus faibles que ceux sur le côté avec une concentration plus faible de HGF. Les résultats suggèrent que ce nouveau système expérimental est approprié pour explorer d’autres questions dans les domaines impliquant la migration cellulaire collective sous des gradients chimiques de divers facteurs solubles.
Protocol
Representative Results
Discussion
La migration collective des cellules constituantes est un processus important pendant le développement et la régénération, et la direction de migration est souvent guidée par le gradient chimique des facteurs de croissance4,23. Pendant la migration collective, les cellules continuent d’interagir avec les cellules voisines et les substrats sous-jacents. De telles interactions mécaniques donnent lieu à des phénomènes émergents tels que le durotaxis<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention de la National Research Foundation of Korea (NRF) financée par le gouvernement coréen (MSIP) (No. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant et le programme BK 21 Plus. Il a également été soutenu par les National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).
Materials
| 0.25% trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| 1 M HEPES buffer solution | Gibco | 15630-056 | |
| 1 mm Biopsy punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| 100 mm petri dishes | SPL | 10100 | 100 mm diameter, 15 mm height |
| 14 mm hollow punch | ILJIN | 124-0571 | |
| 18 mm Ø Coverslip | Marienfeld-Superior | 111580 | Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm) |
| 2% bis-acrylamide solution | Bio-Rad | 1610142 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) | Sigma-Aldrich | 440159-500ML | |
| 3-way stopcock | Hyupsung | HS-T-61N | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 30 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-30 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| 35 mm cell culture dish | Corning | 430165 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-Rad | 1610140 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| 75 cm minimum volume line (for pediatric) | Hyupsung | HS-MV-75 | CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse |
| acetic acid | J.T. Baker | JT9508-03 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Bio-Rad | 1610700 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| Bottom glass chip | MicroFIT | 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm) | |
| Collagen typeI, Rat tail | Corning | 354236 | |
| Custom glass holder | Han-Gug Mechatronics | custom-made | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Welgene | LM 001-11 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biowest | L0615-500 | w/o Magnesium, Calcium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 26140-179 | |
| FluoSpheres amine-modified microspheres | Invitrogen | F8764 | 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515) |
| Hepatocyte Growth Factor (HGF) | Sigma-Aldrich | H1404-5UG | recombinant, human |
| JuLI stage live cell imaging system | NanoEnTek In | Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2) | |
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell | type II | ||
| Oxygen plasma system | Femto Science | CUTE-MPR | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| Rhodamine B isothiocyanate–dextran | Sigma-Aldrich | R9379-100MG | 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel |
| Steril hypodermic needle 18 G | KOVAX | Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line | |
| Sticky tape | 3M/Scotch | 810D | 33 m x 19 mm |
| SU-8 master molds | MicroFIT | 4” diameter, custom-made | |
| sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) | Thermo Scientific | 22589 | Store at -20°C. Store protected from moisture and light. |
| Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS | |
| Syringe pump | Chemyx Inc. | model fusion 720 | withdraw fluid |
| Syringes | KOVAX | 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump | |
| tetramethylethylenediamine (TEMED) | Bio-Rad | 1610800 | Wear protective gloves, clothing, and eye protection. |
| Ultraviolet (UV) lamp | UVP LLC | 95-0248-02 | 365 nm wavelength |
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