JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Тракция Микроскопия интегрирована с микрофлюиди для хемотаксической коллективной миграции

Published: October 13, 2019
doi:
10.3791/60415
, , , , ,
1Department of Biomedical Sciences,Korea University, 2Department of Mechanical Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health,Harvard T.H. Chan School of Public Health

Summary

Коллективная миграция клеток в развитии, заживлении ран и метастазах рака часто руководствуются градиентами факторов роста или сигнальными молекулами. Описана экспериментальная система, сочетающая в себе мастикную микроскопию с микрофлюидной системой и демонстрацию того, как количественно определить механику коллективной миграции под биохимическим градиентом.

Abstract

Клетки меняют модели миграции в ответ на химические раздражители, включая градиенты стимулов. Клеточная миграция в направлении химического градиента, известного как химиотаксис, играет важную роль в развитии, иммунном ответе, заживлении ран и метастазах рака. В то время как химиотаксис модулирует миграцию одиночных клеток, а также коллекции клеток in vivo, исследования in vitro сосредоточены на одноклеточных хемотаксисах, отчасти из-за отсутствия надлежащих экспериментальных инструментов. Чтобы заполнить этот пробел, описанный здесь является уникальной экспериментальной системой, которая сочетает в себе микрофлюиды и микропаттерны, чтобы продемонстрировать влияние химических градиентов на коллективную миграцию клеток. Кроме того, в систему включены масковая микроскопия и монослойная микроскопия стресса для характеристики изменений в клеточной силе как на субстрате, так и между соседними клетками. В качестве доказательства концепции, миграция микропаттернированных круговых островов Клетки собачьей почки Мадин-Дарби (MDCK) тестируется под градиентом фактора роста гепатоцитов (HGF), известного фактора рассеяния. Установлено, что клетки, расположенные вблизи более высокой концентрации HGF, мигрируют быстрее, чем клетки на острове клеток. На том же острове клеточная тяга схожа с обеих сторон, но межклеточный стресс значительно ниже на стороне более высокой концентрации HGF. Эта новая экспериментальная система может предоставить новые возможности для изучения механики химиотаксической миграции клеточных коллективов.

Introduction

Клеточная миграция в биологических системах является фундаментальным явлением, участвующим в формировании тканей, иммунный ответ, и заживление ран1,2,3. Клеточная миграция также является важным процессом при некоторых заболеваниях, таких как рак4. Клетки часто мигрируют как группа, а не индивидуально, что известно как коллективная миграция клеток4,5. Для клеток, чтобы двигаться коллективно, зондирование микросреды имеет важное значение6. Например, клетки воспринимают физико-химические стимулы и реагируют, изменяя подвижность, взаимодействие клеток и клеточные взаимодействия, что приводит к направленной миграции вдоль химического градиента7,8, 9,10. Основываясь на этой связи, быстрые достижения были сделаны в лаборатории на чип технологий, которые могут создавать хорошо контролируемые химические микросреды, такие как градиент химиоаттрактора11,12,13 . Хотя эти лаборатории-на-чип основе микрофлюиды ранее были использованы для изучения химиотаксиса клеточного ансамбля или клеточных сфероидов14,15,16,17, они были использованы в основном в контексте одноклеточной миграции18,19,20,21. Механизмы, лежащие в основе клеточного коллективного ответа на химический градиент, до сих пор не очень хорошо изучены14,22,23,24,25,26 . Таким образом, разработка платформы, позволяющей пространственно-временноконтролировать растворимые факторы, а также наблюдение за биофизическими клетками на месте поможет распутать механизмы коллективной миграции клеток.

Разработанная и описанная здесь многоканальная микрофлюидная система, которая позволяет образовывать градиент концентрации растворимых факторов, который модулирует миграцию узорчатых клеточных кластеров. В этом исследовании, гепатоцитов фактор роста (HGF) выбран для регулирования миграционного поведения Мадин-Дарби собачьих почек (MDCK) клеток. HGF, как известно, ослаблении целостности клеток и повышения подвижности клеток27,28. В микрофлюидной системе, Фурье трансформировать тяговой микроскопии и монослой стресс микроскопии также включены, что позволяет анализподвижности, контрактной силы и межклеточного напряжения индуцированных составных клеток в ответ на HGF Градиент. На том же острове клетки, расположенные вблизи более высокой концентрации HGF, мигрируют быстрее и показывают более низкие уровни межклеточного стресса, чем на стороне с более низкой концентрацией HGF. Полученные результаты свидетельствуют о том, что эта новая экспериментальная система подходит для изучения других вопросов в областях, связанных с коллективной клеточной миграцией под химическими градиентами различных растворимых факторов.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Литография su-8 формы для трафаретов (толщина 250 мкм) и микроканальных частей (толщина 150 мкм), стеклянное травление (глубина 100 мкм), и литые изготовления были переданы на аутсорсинг путем отправки конструкций с помощью компьютерного программного обеспечения дизайна для произ?…

Representative Results

Для изучения коллективной миграции под химическим градиентом, микрофлюидная система была интегрирована с масковой микроскопией(рисунок 1). Для построения интегрированной системы гель полиакриламид (PA) был отлит на специально вырезанном стекле, а клетки MDCK были посеяны…

Discussion

Коллективная миграция составных клеток является важным процессом в процессе развития и регенерации, и мигрирующее направление часто руководствуется химическим градиентом факторов роста4,23. Во время коллективной миграции клетки продолжают взаимодейст…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Грантом Национального исследовательского фонда Кореи (NRF), финансируемым корейским правительством (MSIP) (No. NRF-2017R1E1A1A1A01075103), Корейский университетский грант и программа BK 21 Plus. Он также был поддержан Национальными институтами здравоохранения (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL0071118, R01EY019696).

Materials

0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Tags

Traction MicroscopyMicrofluidicsCollective Cell MigrationBiochemical GradientCellular ForcesPDMSSU-8 MoldGlass Slide SilanizationPolyacrylamide Gel
check_url/pt/60415?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image