JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Traktionsmikroskopi integrerat med mikrofluidik för Chemotactic kollektiv migration

Published: October 13, 2019
doi:
10.3791/60415
, , , , ,
1Department of Biomedical Sciences,Korea University, 2Department of Mechanical Engineering,Korea Advanced Institute of Science and Technology, 3Department of Environmental Health,Harvard T.H. Chan School of Public Health

Summary

Kollektiv cell migration i utveckling, sårläkning och cancermetastaser styrs ofta av gradienter av tillväxtfaktorer eller signalmolekyler. Här beskrivs ett experimentellt system som kombinerar traktionsmikroskopi med ett microfluidiskt system och en demonstration av hur man kan kvantifiera mekaniken i kollektiv migration under biokemisk gradient.

Abstract

Celler förändrar migrationsmönstren som svar på kemiska stimuli, inklusive lutningar av stimuli. Cellulär migration i riktning mot en kemisk gradient, känd som chemotaxis, spelar en viktig roll i utvecklingen, immunförsvaret, sårläkning, och cancermetastaser. Medan chemotaxis modulerar migration av enskilda celler samt samlingar av celler in vivo, in vitro-forskning fokuserar på encelliga chemotaxis, delvis på grund av avsaknaden av rätt experimentella verktyg. För att fylla denna lucka, beskrivs här är ett unikt experiment system som kombinerar mikrofluidik och micropatterning att demonstrera effekterna av kemiska gradienter på kollektiv cell migration. Dessutom är traktion mikroskopi och enskiktslager stress mikroskopi införlivas i systemet för att karakterisera förändringar i cellulära kraft på underlaget samt mellan angränsande celler. Som proof-of-koncept, migration av mikromönstrade cirkulära öar av Madin-Darby Hundarnas njure (MDCK) celler testas under en gradient av hepatocyte tillväxtfaktor (HGF), en känd spridnings faktor. Det finns att celler som ligger nära den högre koncentrationen av HGF migrerar snabbare än de på motsatt sida inom en cellö. Inom samma ö, cellulära dragkraft är liknande på båda sidor, men intercellulära stress är mycket lägre på sidan av högre HGF koncentration. Detta nya experimentella system kan ge nya möjligheter att studera mekaniken i kemotaktisk migration av cellulära kollektiv.

Introduction

Cellulär migration i biologiska system är ett grundläggande fenomen som är involverade i vävnads bildningen, immunförsvaret och sårläkning1,2,3. Cellulär migration är också en viktig process i vissa sjukdomar som cancer4. Celler migrerar ofta som en grupp snarare än individuellt, vilket kallas kollektiv cellmigrering4,5. För celler att röra sig kollektivt, avkänning av mikromiljön är viktigt6. Till exempel, celler uppfattar fysikalisk-kemiska stimuli och reagera genom att ändra motilitet, cell-substrat interaktioner, och cell-cell interaktioner, vilket resulterar i riktad migration längs en kemisk gradient7,8, 9,10. Baserat på denna anslutning, snabba framsteg har gjorts i Lab-on-a-chip teknik som kan skapa välkontrollerade kemiska mikromiljöer såsom lutningen på en Chemoattractant11,12,13 . Även om dessa Lab-on-a-chip-baserade mikrofluidik har tidigare använts för att studera chemotaxis av den cellulära ensemblen eller cellulära spheroids14,15,16,17, de har använts mest i samband med Single-cell migration18,19,20,21. Mekanismerna bakom ett cellulärt kollektivt svar på en kemisk gradient är fortfarande inte väl förstådda14,22,23,24,25,26 . Utvecklingen av en plattform som möjliggör en rumslig kontroll av lösliga faktorer samt observation av cellernas biofysik bidrar således till att riva upp mekanismerna bakom kollektiv cell migration.

Utvecklad och beskrivs här är en multi-kanaliseras mikroflödessystem system som möjliggör generering av en koncentration gradient av lösliga faktorer som modulerar migration av mönstrade cell kluster. I denna studie, hepatocyte tillväxtfaktor (HGF) väljs för att reglera migrations beteendet hos Madin-Darby Hundarnas njure (MDCK) celler. HGF är känt för att dämpa cell cellernas integritet och förbättra motiliteten hos cellerna27,28. I mikroflödessystem systemet, Fourier Transform traktion mikroskopi och enskiktslager stress mikroskopi ingår också, vilket möjliggör analys av motilitet, kontraktila kraft, och intercellulära spänningar induceras av konstituerande celler som svar på en HGF Lutning. Inom samma ö, celler som ligger nära den högre koncentrationen av HGF migrera snabbare och Visa lägre intercellulära stressnivåer än de på sidan med lägre HGF koncentration. Resultaten tyder på att detta nya experimentella system är lämpligt att utforska andra frågor inom områden som inbegriper kollektiv cellulär migration under kemiska gradienter av olika lösliga faktorer.

Protocol

Anmärkning: litografi av SU-8 formar för stenciler (tjocklek = 250 μm) och MicroChannel-delar (tjocklek = 150 μm), glas etsning (djup = 100 μm), och gjuten tillverkning lades ut genom att skicka mönster med hjälp av datorstödd designprogramvara till tillverkare. 1. tillverkning av Polydimetylsiloxan (PDMS) stencil och MicroChannel- Designa mikromönstret av stencil och MicroChannel. Fabricera eller outsourca SU-8 formar (tjocklek av ~ 250 μm för stenciler och ~ 15…

Representative Results

För att utforska kollektiv migration under en kemisk gradient integrerades ett microfluidiskt system med traktionsmikroskopi (figur 1). För att bygga det integrerade systemet, polyakrylamid (PA) gel var gjuten på Specialskurna glas, och MDCK celler var seedade inom mikromönstrade öar som gjorts av en PDMS stencil. För detta experiment skapades tolv öar av MDCK-celler (fyra ror vid tre kolonner, diameter av ~ 700 μm). Efter celler som är kopplade till PA Gels togs PDMS-stencilen bort…

Discussion

Kollektiv migration av konstituerande celler är en viktig process under utveckling och förnyelse, och migrations riktningen styrs ofta av tillväxtfaktorernas kemiska lutning4,23. Under kollektiv migration, celler hålla interagera med angränsande celler och underliggande substrat. Sådana mekaniska interaktioner ger upphov till framväxande fenomen som durotaxis42, plithotaxis33, och kenotaxis4…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av National Research Foundation of Korea (NRF) bidrag finansieras av den koreanska regeringen (MSIP) (No. NRF-2017R1E1A1A01075103), Korea University Grant och BK 21 plus-programmet. Det stöddes också av National Institutes of Health (U01CA202123, PO1HL120839, T32HL007118, R01EY019696).

Materials

0.25% trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
1 M HEPES buffer solution Gibco 15630-056
1 mm Biopsy punch Integra Miltex 33-31AA-P/25
100 mm petri dishes SPL 10100 100 mm diameter, 15 mm height
14 mm hollow punch ILJIN 124-0571
18 mm Ø Coverslip Marienfeld-Superior 111580 Circular 18 mm, thickness No. 1 (0.13 to 0.16 mm)
2% bis-acrylamide solution Bio-Rad 1610142 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate (TMSPMA) Sigma-Aldrich 440159-500ML
3-way stopcock Hyupsung HS-T-61N CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
30 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-30 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
35 mm cell culture dish Corning 430165
40% Acrylamide Solution Bio-Rad 1610140 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
75 cm minimum volume line (for pediatric) Hyupsung HS-MV-75 CAUTION: do not use if previously opened. do not resterlize or resuse
acetic acid J.T. Baker JT9508-03
Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad 1610700
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240-062
Bottom glass chip MicroFIT 24 x 24 x 1 mm, custom-made, rectangular groove (6 x 12 mm, depth : 100 μm)
Collagen typeI, Rat tail Corning 354236
Custom glass holder Han-Gug Mechatronics custom-made
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) Welgene LM 001-11
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Biowest L0615-500 w/o Magnesium, Calcium
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 26140-179
FluoSpheres amine-modified microspheres Invitrogen F8764 0.2 µm, yellow-green fluorescent(505/515)
Hepatocyte Growth Factor (HGF) Sigma-Aldrich H1404-5UG recombinant, human
JuLI stage live cell imaging system NanoEnTek In Automated X-Y-Z stage and fluorsent imaging Incubator-compatible (37 °C and 5% CO2)
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cell type II
Oxygen plasma system Femto Science CUTE-MPR
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443-250G
Rhodamine B isothiocyanate–dextran Sigma-Aldrich R9379-100MG 70 kDa, used to estimate spatiotemporal distribution of HGF in the microfluidic channel
Steril hypodermic needle 18 G KOVAX Trim the tip of the needle and bend it 90 degrees for connecting in/out ports with volume line
Sticky tape 3M/Scotch 810D 33 m x 19 mm
SU-8 master molds MicroFIT 4” diameter, custom-made
sulfosuccinimidyl 6-(4’-azido-2’-nitrophenylamino)hexanoate (Sulfo-SANPAH) Thermo Scientific 22589 Store at -20°C. Store protected from moisture and light.
Sylgard 184 Elastomer Kit Dow Corning PDMS
Syringe pump Chemyx Inc. model fusion 720 withdraw fluid
Syringes KOVAX 1, 3, 5, 10, or 50 cc for using inlet reservoir or outlet syringe pump
tetramethylethylenediamine (TEMED) Bio-Rad 1610800 Wear protective gloves, clothing, and eye protection.
Ultraviolet (UV) lamp UVP LLC 95-0248-02 365 nm wavelength
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Reig, G., Pulgar, E., Concha, M. L. Cell migration: from tissue culture to embryos. Development. 141 (10), 1999-2013 (2014).
  2. Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nature Immunology. 6 (12), 1182-1190 (2005).
  3. Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  4. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 445-457 (2009).
  5. Mayor, R., Etienne-Manneville, S. The front and rear of collective cell migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (2), 97-109 (2016).
  6. DuFort, C. C., Paszek, M. J., Weaver, V. M. Balancing forces: architectural control of mechanotransduction. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (5), 308-319 (2011).
  7. Vogel, V. Mechanotransduction involving multimodular proteins: converting force into biochemical signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
  8. Roca-Cusachs, P., Sunyer, R., Trepat, X. Mechanical guidance of cell migration: lessons from chemotaxis. Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 543-549 (2013).
  9. Weber, G. F., Bjerke, M. A., DeSimone, D. W. A mechanoresponsive cadherin-keratin complex directs polarized protrusive behavior and collective cell migration. Developmental Cell. 22 (1), 104-115 (2012).
  10. Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. FASEB Journal. 20 (7), 811-827 (2006).
  11. Ricart, B. G., Yang, M. T., Hunter, C. A., Chen, C. S., Hammer, D. A. Measuring traction forces of motile dendritic cells on micropost arrays. Biophysical Journal. 101 (11), 2620-2628 (2011).
  12. Garcia, S., et al. Generation of stable orthogonal gradients of chemical concentration and substrate stiffness in a microfluidic device. Lab on a Chip. 15 (12), 2606-2614 (2015).
  13. Zhang, Z., et al. Scalable Multiplexed Drug-Combination Screening Platforms Using 3D Microtumor Model for Precision Medicine. Small. 14 (42), 1703617 (2018).
  14. Ayuso, J. M., et al. Study of the Chemotactic Response of Multicellular Spheroids in a Microfluidic Device. PLoS ONE. 10 (10), 0139515 (2015).
  15. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  16. Ellison, D., et al. Cell-cell communication enhances the capacity of cell ensembles to sense shallow gradients during morphogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 679-688 (2016).
  17. Fujimori, T., Nakajima, A., Shimada, N., Sawai, S. Tissue self-organization based on collective cell migration by contact activation of locomotion and chemotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2019).
  18. Li Jeon, N., et al. Neutrophil chemotaxis in linear and complex gradients of interleukin-8 formed in a microfabricated device. Nature Biotechnology. 20 (8), 826-830 (2002).
  19. Saadi, W., Wang, S. J., Lin, F., Jeon, N. L. A parallel-gradient microfluidic chamber for quantitative analysis of breast cancer cell chemotaxis. Biomedical Microdevices. 8 (2), 109-118 (2006).
  20. Abhyankar, V. V., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Characterization of a membrane-based gradient generator for use in cell-signaling studies. Lab on a Chip. 6 (3), 389-393 (2006).
  21. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35 (8), 2454-2461 (2014).
  22. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  23. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  24. McCutcheon, S., et al. In vitro formation of neuroclusters in microfluidic devices and cell migration as a function of stromal-derived growth factor 1 gradients. Cell Adhesion & Migration. 11 (1), 1-12 (2017).
  25. Rorth, P. Whence directionality: guidance mechanisms in solitary and collective cell migration. Developmental Cell. 20 (1), 9-18 (2011).
  26. Rorth, P. Collective guidance of collective cell migration. Trends in Cell Biology. 17 (12), 575-579 (2007).
  27. Farrell, J., et al. HGF induces epithelial-to-mesenchymal transition by modulating the mammalian hippo/MST2 and ISG15 pathways. Journal of Proteome Research. 13 (6), 2874-2886 (2014).
  28. Wang, T. W., Zhang, H., Gyetko, M. R., Parent, J. M. Hepatocyte growth factor acts as a mitogen and chemoattractant for postnatal subventricular zone-olfactory bulb neurogenesis. Molecular and Cellular Neuroscience. 48 (1), 38-50 (2011).
  29. Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical Review. E, Statistical, Nonlinear and Soft matter Physics. 82, 041918 (2010).
  30. Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
  31. Denisin, A. K., Pruitt, B. L. Tuning the Range of Polyacrylamide Gel Stiffness for Mechanobiology Applications. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21893-21902 (2016).
  32. Jang, H., et al. Traction microscopy with integrated microfluidics: responses of the multi-cellular island to gradients of HGF. Lab on a Chip. 19 (9), 1579-1588 (2019).
  33. Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
  34. Jang, H., et al. Homogenizing cellular tension by hepatocyte growth factor in expanding epithelial monolayer. Scientific Reports. 8, 45844 (2017).
  35. Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5 (6), 426 (2009).
  36. Tolic-Norrelykke, I. M., Butler, J. P., Chen, J., Wang, N. Spatial and temporal traction response in human airway smooth muscle cells. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 283 (4), 1254-1266 (2002).
  37. Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology – Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
  38. Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PLoS ONE. 8 (2), 55172 (2013).
  39. Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
  40. Wang, N., et al. Cell prestress. I. Stiffness and prestress are closely associated in adherent contractile cells. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 282 (3), 606-616 (2002).
  41. Notbohm, J., et al. Cellular Contraction and Polarization Drive Collective Cellular Motion. Biophysical Journal. 110 (12), 2729-2738 (2016).
  42. Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
  43. Kim, J. H., et al. Propulsion and navigation within the advancing monolayer sheet. Nature Materials. 12 (9), 856-863 (2013).

Tags

Traction MicroscopyMicrofluidicsCollective Cell MigrationBiochemical GradientCellular ForcesPDMSSU-8 MoldGlass Slide SilanizationPolyacrylamide Gel
check_url/pt/60415?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Jang, H., Kim, J., Shin, J. H., Fredberg, J. J., Park, C. Y., Park, Y. Traction Microscopy Integrated with Microfluidics for Chemotactic Collective Migration. J. Vis. Exp. (152), e60415, doi:10.3791/60415 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image