Автоматизированная центробежная система Counterflow для мелкомасштабной обработки ячеек
Summary
Автоматизация является ключом к наращиванию масштабов и управлению затратами в производстве ячеек. Данная рукопись описывает использование устройства обработки центробежных клеток против потока для автоматизации буферного обмена и шагов концентрации клеток для мелкомасштабной биообработки.
Abstract
Успешная коммерциализация генной и клеточной терапии требует производственных процессов, которые являются экономически эффективными и масштабируемыми. Обмен буферами и концентрация продукта являются важными компонентами для большинства производственных процессов. Однако на ранних стадиях разработки продукта эти шаги часто выполняются вручную. Ручная тупиковая центробежка для буферного обмена является трудоемкой, дорогостоящей и не масштабируемой. Закрытая автоматизированная система может эффективно устранить этот трудоемкий шаг, но реализация может быть сложной задачей. Здесь мы описываем недавно разработанное устройство обработки ячеек, которое подходит для обработки ячеек малого и среднего масштаба и направлено на преодоление разрыва между ручной обработкой и крупномасштабной автоматизацией. Этот протокол может быть легко применен к различным типам и процессам клеток путем изменения скорости потока и скорости центрифугирования. Наш протокол продемонстрировал высокое восстановление клеток с более коротким временем обработки по сравнению с ручным процессом. Клетки, извлеченные из автоматизированного процесса, также поддерживали скорость распространения. Устройство может быть применено в качестве модульного компонента в закрытом производственном процессе для размещения таких этапов, как буферный обмен, формулировка ячейки и криоконсервация.
Introduction
Ландшафт современной медицины быстро преобразился благодаря последним разработкам в области генной и клеточной терапии (GCT). Будучи одной из наиболее быстро растущих областей в области трансляционных исследований, сектор GCT также сталкивается с уникальными и беспрецедентными проблемами. В дополнение к надежным клиническим результатам, эффективные и экономически эффективные производственные процессы имеют важное значение для коммерческого успеха GCT, который особенно трудно достичь в мелкомасштабной обрабатывающей промышленности1. Стоимость времени, труда и гарантий качества увеличивается, когда каждая партия клеток производит только несколько доз на одного пациента, а не сотни или тысячи. В отличие от аллогенной клеточной терапии, в которой производственные процессы больше похожи на производство антител и рекомбинантных белков, аутологичные клеточные методы лечения, как правило, производятся как мелкомасштабные операции1. Как относительно новое явление в биофармацевтическом производстве2, варианты мелкомасштабной обработки клеток в настоящее время весьма ограничены.
Буферный обмен имеет важное значение для производства клеток. Это один из процессов, происходящих вниз по течению, где клетки удаляются из культурных носителей и концентрируются для криоконсервации или инфузии. В настоящее время мелкомасштабное производство клеток часто применяется процессы, аналогичные тем, которые в академических исследований настройки и опирается на специализированные чистые комнаты для поддержания бесплодия3. Ручные процессы вниз по течению часто используют центрифуги скамейки для гранул и повторной работы ячеек для уменьшения объема и буферного обмена. Эти открытые процессы являются дорогостоящими (т.е. обслуживание рабочей силы и чистой комнаты) и имеют ограниченные производственные мощности, которые не являются идеальными для коммерческого производства2,3.
Внедрение автоматизации было предложено в качестве решения для повышения эффективности производства и достижения коммерческих производств2. Стерильность не может быть достигнута в клеточных продуктах с помощью традиционных методов, используемых для биопрепаратов, таких как гамма-облучение или терминальная фильтрация конца. Вместо этого, автоматизированная закрытая система развернута для снижения риска загрязнения и операторов, полагающих на чистые помещения для поддержания стерильности4. Автоматизация процессов также решает проблему масштабируемости, либо имея несколько систем, работающих параллельно (масштабирование), либо увеличивая вычислительную мощность отдельного устройства (масштабирование), что, в свою очередь, сводит к минимуму изменчивость между операторами. Кроме того, анализ затрат моделирования аутологичных методов лечения позволяет предположить, что автоматизация может снизить затраты на производство5,6. Тем не менее, никакой выгоды не было найдено в аутологичном клиническом испытании стволовых клеток, где автоматизированная производственная платформа была использована7, предполагая, что рентабельность автоматизации может зависеть от индивидуального производственного процесса.
Существуют различные стратегии, в которых автоматизация может быть введена в существующий производственный процесс. Этого можно достичь либо путем внедрения полностью интегрированной платформы, либо модульной цепочки обработки. Есть несколько полностью интегрированных платформ, коммерчески доступных для аутологического производства клеток, таких как CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Кокон (Octane Biotech) и Квантовая (Terumo BCT). Эти интегрированные платформы, которые часто называют «GMP-in-a-box», имеют низкие требования к инфраструктуре и просты в эксплуатации. Однако производственные мощности полностью интегрированной установки могут быть ограничены инкубатором, подключенным к системе. Например, культивирование мощности Prodigy ограничено его 400 мл камеры8 и квантовый картридж имеет предельную площадь поверхности установлен 2,1 м2 (эквивалент 120 T175 колбы)7, которые не могут быть достаточными для пациентов, нуждающихся в более высоких дозах клеток9,10. Кроме того, Prodigy и Квантовая имеют общий атрибут, который ограничивает их использование: операционная единица занята одной партии ячеек на протяжении всего периода расширения ячейки, тем самым ограничивая количество партий, которые могут быть изготовлены каждой единицей11. Модульный подход к автоматизации заключается в создании производственной цепочки с несколькими модульными агрегатами, которая имитирует коммерческий производственный процесс12,13. Этот подход, который отделяет прибор культуры от прибора мытья клетки, может таким образом увеличить эффективность изготавливания. Идеальным устройством обработки будет устройство, адаптируемое и масштабируемое для производственных потребностей12.
Технология Counterflow centrifugation (CFC), которая восходит к 1970-м годы, имеет долгую историю в обработке клеток14. Он достигает концентрации клеток и разделения, балансируя центробежную силу с силой контрпотока. Как правило, суспензия ячейки входит из узкого конца камеры клетки при постоянной скорости потока при условии центробежной силы(рисунок 1А). Поток жидкости оказывается в противоположном направлении к центробежной силе. Это называется силой встречного потока, которая образует градиент в ячейке. Сила контрпотока затем уменьшается по мере того как камера клетки расширяет далеко от кончика конус-образной камеры клетки. Клетки с более высокой плотностью и большим диаметром имеют более высокую скорость осадка, и таким образом они достигают силового равновесия к кончику конусообразной клеточной камеры. Меньшие частицы могут достичь равновесия к основанию камеры или быть слишком малы, чтобы быть сохранены в камере и будут смыты. Технология CFC в основном известна своим применением в обработке продуктов афересеза крови, таких как изолирующие моноциты для дендритной клеточной терапии15,16. С точки зрения буферного обмена, технология ХФУ применяется только в крупномасштабном производстве17 и до сих пор не используется для меньшего масштаба производства аутологичной клеточной терапии.
Для удовлетворения потребности в подходящем устройстве для мелкомасштабного производства ячеек, автоматизированное устройство ХФУ (см. Таблица материалов), был недавно разработан18. Автоматизированное устройство обработки клеток использует технологию центрифугирования контрпотока для удаления мусора и облегчения буферного обмена. Устройство выполняет буферный обмен с одноразовым набором, который может быть стерильным подключен к сумке для передачи ячейки, что позволяет обрабатывать ячейки в стерильной, закрытой системе. Здесь мы исследуем использование центробежного устройства противпотока для выполнения буферного обмена в культурах клеток млекопитающих в автоматизированных протоколах. В этом исследовании мы протестировали протокол буферного обмена с использованием ячеек Jurkat и мезенхимальных стромальных ячеек (MSC) для моделирования типов неприверженных и придерживающихся клеток, соответственно. Клетки jurkat увековечены Т-клетки часто используются для изучения острого Т-клеточного лейкоза19,20. MSCs взрослые стволовые клетки, которые были изучены в клинических испытаниях на людях для широкого спектра заболеваний9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный автоматизированный протокол обмена буфером прост и удобен для пользователя. Тем не менее, есть несколько ключевых шагов в этом протоколе, которые имеют решающее значение и требуют особого внимания. По нашему опыту, при обработке более крупных клеток, таких как MSC (средний диам…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Викторианской правительством оперативной программы поддержки инфраструктуры, а также викторианской правительства технологии ваучер, предоставляемый Департаментом экономического развития, рабочих мест, транспорта и ресурсов. RL является получателем Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям Карьера развития стипендий. AL является лауреатом Австралийской премии последипломного образования.
Materials
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
Referências
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 1. BioProcess International. 16 (3), (2018).
- Hampson, B., Ceccarelli, J. Factories of the future: Can Patient-Specific Cell Therapies Get There from Here?. BioProcess International. 14 (4), (2016).
- Preti, R., Daus, A., Hampson, B., Sumen, C. Mapping success for commercial cell therapy manufacturing. BioProcess International. 13 (9), 33-38 (2015).
- Heathman, T. R., et al. The translation of cell-based therapies: clinical landscape and manufacturing challenges. Regenerative Medicine. 10 (1), 49-64 (2015).
- Lipsitz, Y. Y., et al. A roadmap for cost-of-goods planning to guide economic production of cell therapy products. Cytotherapy. 19 (12), 1383-1391 (2017).
- Lopes, A. G., Sinclair, A., Frohlich, B. Cost Analysis of Cell Therapy Manufacture: Autologous Cell Therapies, Part 2. BioProcess International. 16 (4), 12-19 (2018).
- Hanley, P. J., et al. Efficient manufacturing of therapeutic mesenchymal stromal cells with the use of the Quantum Cell Expansion System. Cytotherapy. 16 (8), 1048-1058 (2014).
- Leong, W., Nakervis, B., Beltzer, J. Automation: what will the cell therapy laboratory of the future look like?. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 679-694 (2018).
- Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
- Salmikangas, P., Kinsella, N., Chamberlain, P. Chimeric Antigen Receptor T-Cells (CAR T-Cells) for Cancer Immunotherapy – Moving Target for Industry?. Pharmaceutical Research. 35 (8), 152 (2018).
- James, D. How short-term gain can lead to long-term pain. Cell Gene Therapy Insights. 3 (4), 271-284 (2017).
- Rafiq, Q. A., Thomas, R. J. The evolving role of automation in process development, manufacture of cell, gene-based therapies. Cell Gene Therapy Insights. 2 (4), 473-479 (2016).
- Rafiq, Q. A. Emerging Automated Approaches for Cell and Gene Therapy Manufacture. Cell Gene Therapy Insights. 4 (9), 911-914 (2018).
- Contreras, T. J., Jemionek, J. F., French, J. E., Shields, L. J. Human Granulocyte Isolation by Continuous Flow Centrifugation Leukapheresis and Counterflow Centrifugation Elutriation (CFCL/CCE). Transfusion. 19 (6), 695-703 (1979).
- Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra™) for clinical-scale generation of dendritic cells. Journal of Immunological Methods. 298 (1), 61-72 (2005).
- Chen, Y., Hoecker, P., Zeng, J., Dettke, M. Combination of Cobe AutoPBSC and Gambro Elutra as a platform for monocyte enrichment in dendritic cell (DC) therapy: Clinical study. Journal of Clinical Apheresis. 23 (5), 157-162 (2008).
- Whitford, W. G., Subramanian, G. . Continuous Processing in Pharmaceutical Manufacturing. , (2014).
- . SMALL BATCH CELL SEPARATION, WASH & CONCENTRATION Available from: https://www.scinogy.com/projects (2019)
- Yu, D., et al. Targeting Jurkat T Lymphocyte Leukemia Cells by an Engineered Interferon-Alpha Hybrid Molecule. Cellular Physiology and Biochemistry. 42 (2), 519-529 (2017).
- Moharram, S. A., Shah, K., Kazi, J. U. T cell Acute Lymphoblastic Leukemia Cells Display Activation of Different Survival Pathways. Journal of Cancer. 8 (19), 4124 (2017).
- Ling, W., et al. Mesenchymal stem cells use IDO to regulate immunity in tumor microenvironment. Pesquisa do Câncer. 74 (5), 1576-1587 (2014).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnology and Bioengineering. 104 (2), 360-370 (2009).
- Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers. Tissue engineering. Part A. 18 (7-8), 806-815 (2012).
- Zhu, F., et al. Hydroxyethyl starch as a substitute for dextran 40 for thawing peripheral blood progenitor cell products. Cytotherapy. 17 (12), 1813-1819 (2015).
- Schwandt, S., Korschgen, L., Peters, S., Kogler, G. Cord blood collection and processing with hydroxyethyl starch or non-hydroxyethyl starch. Cytotherapy. 18 (5), 642-652 (2016).
- Stroncek, D. F., et al. Counter-flow elutriation of clinical peripheral blood mononuclear cell concentrates for the production of dendritic and T cell therapies. Journal of Translational Medicine. 12, 241 (2014).
- Mfarrej, B., et al. Pre-clinical assessment of the Lovo device for dimethyl sulfoxide removal and cell concentration in thawed hematopoietic progenitor cell grafts. Cytotherapy. 19 (12), 1501-1508 (2017).
- Abonnenc, M., Pesse, B., Tissot, J. D., Barelli, S., Lion, N. Automatic washing of thawed haematopoietic progenitor cell grafts: a preclinical evaluation. Vox Sanguinis. 112 (4), 367-378 (2017).
- Panes, J., et al. Expanded allogeneic adipose-derived mesenchymal stem cells (Cx601) for complex perianal fistulas in Crohn’s disease: a phase 3 randomised, double-blind controlled trial. Lancet. 388 (10051), 1281-1290 (2016).
- Lim, R., et al. First-In-Human Administration of Allogeneic Amnion Cells in Premature Infants With Bronchopulmonary Dysplasia: A Safety Study. Stem Cells Translational Medicine. 7 (9), 628-635 (2018).
