Automatisiertes Gegenstromzentrifugalsystem für die Kleinzellverarbeitung

Summary

Automatisierung ist der Schlüssel zum Upscaling und Kostenmanagement in der Zellfertigung. Dieses Manuskript beschreibt den Einsatz eines Gegenstromzentrifugalzellverarbeitungsgeräts zur Automatisierung des Pufferaustauschs und der Zellkonzentrationsschritte für die kleinräumige Bioverarbeitung.

Abstract

Eine erfolgreiche Kommerzialisierung von Gen- und zellbasierten Therapien erfordert kostengünstige und skalierbare Herstellungsprozesse. Pufferaustausch und Produktkonzentration sind wesentliche Komponenten für die meisten Fertigungsprozesse. In den frühen Stadien der Produktentwicklung werden diese Schritte jedoch häufig manuell ausgeführt. Die manuelle Sackgassenzentrifufugation für den Pufferaustausch ist arbeitsintensiv, kostspielig und nicht skalierbar. Ein geschlossenes automatisiertes System kann diesen mühsamen Schritt effektiv eliminieren, aber die Implementierung kann eine Herausforderung sein. Hier beschreiben wir ein neu entwickeltes Zellverarbeitungsgerät, das sich für die kleine bis mittlere Zellverarbeitung eignet und die Lücke zwischen manueller Verarbeitung und großflächiger Automatisierung überbrücken soll. Dieses Protokoll kann einfach auf verschiedene Zelltypen und Prozesse angewendet werden, indem die Durchflussrate und die Zentrifugationsgeschwindigkeit geändert werden. Unser Protokoll zeigte eine hohe Zellwiederherstellung mit kürzeren Verarbeitungszeiten im Vergleich zum manuellen Prozess. Zellen, die sich aus dem automatisierten Prozess erholten, hielten auch ihre Proliferationsraten aufrecht. Das Gerät kann als modulare Komponente in einem geschlossenen Fertigungsprozess eingesetzt werden, um Schritte wie Pufferaustausch, Zellformulierung und Kryokonservierung aufzunehmen.

Introduction

Die Landschaft der modernen Medizin hat sich durch die jüngsten Entwicklungen in Gen- und Zelltherapien (GCT) rasant verändert. Als eines der am schnellsten wachsenden Bereiche der Translationsforschung steht auch der GCT-Sektor vor einzigartigen und beispiellosen Herausforderungen. Neben robusten klinischen Ergebnissen sind effiziente und kostengünstige Herstellungsverfahren entscheidend für den wirtschaftlichen Erfolg von GCT, der in der Kleinfertigung besonders schwer zu erreichen ist¹. Die Kosten für Zeit, Arbeit und Qualitätssicherung werden erhöht, wenn jede Zellcharge nur wenige Dosen für einen Patienten anstatt für Hunderte oder Tausende produziert. Im Gegensatz zu allogenen Zelltherapien, bei denen die Herstellungsverfahren eher der Produktion von Antikörpern und rekombinanten Proteinen ähneln, werden autologe Zelltherapien typischerweise als kleinräumige Operationen produziert¹. Als relativ neues Phänomen in der biopharmazeutischen Fertigung²sind die Möglichkeiten für die Zellverarbeitung in kleinem Maßstab derzeit recht begrenzt.

Der Pufferaustausch ist für die Zellfertigung unerlässlich. Es ist einer der nachgelagerten Prozesse, bei denen Zellen aus Kulturmedien entfernt und zur Kryokonservierung oder Infusion konzentriert werden. Derzeit wendet die Herstellung von Kleinzellen häufig Ähnliche Prozesse an wie im akademischen Forschungsumfeld und setzt auf spezialisierte Reinräume, um die Sterilität zu erhalten³. Manuelle nachgelagerte Prozesse verwenden häufig Tischzentrifugen, um Zellen zur Volumenreduzierung und Pufferaustausch zu besinnen und wieder auszusetzen. Diese offenen Prozesse sind kostspielig (d.h. Arbeits- und Reinraumpflege) und haben eine begrenzte Fertigungskapazität, die nicht ideal für die kommerzielle Produktion^2,3sind.

Die Implementierung von Automatisierung wurde als Lösung zur Verbesserung der Fertigungseffizienz und zur Erreichung kommerzieller Produktionen^{vorgeschlagen 2}. Sterilität kann in zellbasierten Produkten nicht durch traditionelle Methoden für Biologika wie Gammabestrahlung oder Endendfiltration erreicht werden. Stattdessen wird ein automatisiertes geschlossenes System eingesetzt, um das Risiko von Kontaminationen zu reduzieren, und Betreiber, die auf Reinräume angewiesen sind, um die Sterilität zu erhalten⁴. Die Prozessautomatisierung behebt auch das Problem der Skalierbarkeit, indem entweder mehrere Systeme parallel ausgeführt werden (Scale-out) oder die Verarbeitungskapazität eines einzelnen Geräts erhöht wird (Scale-up), wodurch die Variabilität zwischen den Operatoren minimiert wird. Darüber hinaus legt die Kostenmodellierungsanalyse autologer Therapiennahe, dass die Automatisierung die Herstellungskosten 5^,6reduzieren kann. In einer autologen klinischen Stammzellstudie, in der eine automatisierte Fertigungsplattform verwendet wurde, wurde jedoch kein Kostenvorteil festgestellt⁷, was darauf hindeutet, dass der Kostenvorteil der Automatisierung vom einzelnen Herstellungsprozess abhängen kann.

Es gibt verschiedene Strategien, mit denen Automatisierung in einen bestehenden Fertigungsprozess eingeführt werden kann. Dies kann entweder durch die Implementierung einer vollständig integrierten Plattform oder einer modular enden basierten Verarbeitungskette erreicht werden. Es gibt mehrere voll integrierte Plattformen, die für die autologe Zellherstellung kommerziell erhältlich sind, wie CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec), Cocoon (Octane Biotech) und Quantum (Terumo BCT). Diese integrierten Plattformen, die oft als “GMP-in-a-box” bezeichnet werden, haben geringe Anforderungen an die Infrastruktur und sind einfach zu bedienen. Die Fertigungskapazität eines vollständig integrierten Setups kann jedoch durch den an das System angeschlossenen Inkubator eingeschränkt werden. Beispielsweise ist die Kultivierungskapazität von Prodigy auf seine 400 ml Kammer⁸ begrenzt und die Quantum-Patrone hat eine begrenzunge Oberfläche von 2,1^m2 (entspricht 120 T175-Kolben)⁷, was für Patienten, die höhere Zelldosen^{benötigen, möglicherweise}nicht ausreicht 9^,10. Darüber hinaus haben Prodigy und Quantum ein gemeinsames Attribut, das ihre Verwendung einschränkt: Die Betriebseinheit wird während des gesamten Zellexpansionszeitraums von einer einzigen Charge nutzbesetzt, wodurch die Anzahl der Chargen begrenzt wird, die von jeder Einheit¹¹hergestellt werden können. Der modulare Automatisierungsansatz besteht darin, eine Fertigungskette mit mehreren modularen Einheiten zu schaffen, die den kommerziellen Fertigungsprozess simuliert^12,13. Dieser Ansatz, der das Kulturgerät vom Zellwaschgerät trennt, kann dadurch die Fertigungseffizienz maximieren. Ein ideales Verarbeitungsgerät wäre ein, das anpassungsfähig und skalierbar an Fertigungsanforderungen¹²ist.

Die CFC-Technologie (Counterflow Zentrifufugation), die bis in die 1970er Jahre zurückreicht, hat eine lange Geschichte in der Zellverarbeitung¹⁴. Es erreicht Zellkonzentration und Trennung durch Ausgleich der Zentrifugalkraft mit einer Gegenströmungskraft. Typischerweise tritt eine Zellsuspension vom schmalen Ende einer Zellkammer unter einer konstanten Durchflussrate ein, während sie einer Zentrifugalkraft ausgesetzt ist (Abbildung 1A). Der Fluss der Flüssigkeit wird in entgegengesetzter Richtung zur Fliehkraft ausgeübt. Dies wird als Gegenstromkraft bezeichnet, die einen Gradienten innerhalb der Zellkammer bildet. Die Gegenströmungskraft nimmt dann ab, wenn sich die Zellkammer von der Spitze der kegelförmigen Zellkammer wegweitet. Zellen mit höherer Dichte und größerem Durchmesser haben eine höhere Sedimentationsrate und erreichen so das Kraftgleichgewicht zur Spitze der kegelförmigen Zellkammer. Kleinere Partikel können das Gleichgewicht zur Basis der Kammer erreichen oder zu klein sein, um in der Kammer zurückgehalten zu werden und werden weggewaschen. Die FCKW-Technologie ist vor allem für ihre Anwendung in der Verarbeitung von Blutapherese-Produkten bekannt, wie die Isolierung von Monozyten für dendritische Zelltherapien^15,16. Im Hinblick auf den Pufferaustausch wurde die FCKW-Technologie nur in der Großfertigung¹⁷ eingesetzt und muss noch für die kleinere Herstellung von autologen Zelltherapien eingesetzt werden.

Um dem Bedarf an einem geeigneten Gerät für die Herstellung kleiner Zellen gerecht zu werden, wurde kürzlich ein automatisiertes FCKW-Gerät (siehe Materialtabelle)^entwickelt. Das automatisierte Zellverarbeitungsgerät nutzt die Gegenflusszentrifugationstechnologie, um Zellablagerungen zu entfernen und den Pufferaustausch zu erleichtern. Das Gerät führt einen Pufferaustausch mit einem Einweg-Kit durch, das steril mit einem Zelltransferbeutel verbunden werden kann, wodurch die Zellen in einem sterilen, geschlossenen System verarbeitet werden können. Hier untersuchen wir den Einsatz eines Gegenstromzentrifugalgeräts zur Durchführung eines Pufferaustauschs in Säugetierzellkulturen in automatisierten Protokollen. In dieser Studie testeten wir das Pufferaustauschprotokoll mit Jurkat-Zellen und mesenchymalen Stromalzellen (MSCs), um nicht haftende bzw. anhaftende Zelltypen zu modellieren. Jurkat-Zellen sind verewigte T-Zellen, die häufig für die Untersuchung der akuten T-Zell-Leukämie^19,20verwendet werden. MSCs sind adulte Stammzellen, die in klinischen Studien am Menschen für eine Vielzahl von Krankheiten untersucht wurden⁹.

Protocol

1. Herstellung von Reagenzien und Zellen für den Pufferaustausch Vorbereiten von Puffern (siehe Materialtabelle)in einer laminaren Strömungshaube der Klasse 2. Mit einer Spritze und Nadelbaugruppe 50 ml Salinelösung aus einem 500 ml-Salinebeutel entfernen. Ersetzen Sie dies durch 50 ml 20% humanes Serumalbumin (HSA), um 2% HSA in Saline zu bilden, was als Waschpuffer dient. Entfernen Sie die Zellen aus den Kulturgefäßen, und führen Sie eine Zellanzahl aus, um die Anfangszellenme…

Representative Results

In diesem Protokoll haben wir Jurkat-Zellen und MSCs als repräsentative Beispiele verwendet, um den automatisierten Pufferaustauschprozess zu demonstrieren. Während des Prozesses teilten Jurkat-Zellen und MSCs die gleichen Verarbeitungsschritte mit Unterschieden in der Zentrifugalkraft und Pumpengeschwindigkeit, die die Durchflussmenge steuern (Tabelle 1). Abbildung 2 zeigt repräsentative Bilder, die von der Kamera aufgenommen wurden, wie das wirbelgebundene Zellbett wäh…

Discussion

Das beschriebene automatisierte Pufferaustauschprotokoll ist einfach und benutzerfreundlich. Dennoch gibt es einige wichtige Schritte in diesem Protokoll, die kritisch sind und besondere Aufmerksamkeit erfordern. Nach unserer Erfahrung sollte jeder Durchlauf bei der Verarbeitung größerer Zellen wie MSCs (durchschnittlicher Durchmesser 10–15 m) mindestens 1 x 10⁷ Zellen umfassen, um eine optimale Zellwiederherstellung zu erreichen (Abbildung 4B). Die Verarbeitu…

Materials

20 ml Luer lock syringes	BD	302830
20% Human serum albumin (HSA)	CSL Behring	AUST R 46283
4-(Dimethylamino)benzaldehyde	Sigma-Aldrich	156477-25g
500ml IV saline bag	Fresenius Kabi	K690521
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240112
Automated cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	N/A
Cell counting chamber slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
Cell stimulation cocktail (500x)	Thermo Fisher Scientific	00-4970-93
Cell transfer bags	Terumo	T1BBT060CBB
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G3582
Centrifuge	Eppendorf	5810R
DMEM: F12 media	Thermo Fisher Scientific	11320082
EnVision plate Reader	Perkin Elmer	N/A
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10099141
Human Interleukin 2 (IL2) Kit	Perkin Elmer	Al221C
Luer (female) fittings	CPC	LF41
PC laptop or PC tablet device	ASUS	N/A
Plate reader (SpectraMax i3)	Molecular Device	N/A
Recombinant Human IFN-γ	PeproTech	300-02
Rotea counterflow centrifuge cell processing device	Scinogy	N/A
Rotea single-use processing kit	Scinogy	N/A
RPMI media	Thermo Fisher Scientific	11875119
Surgical scissors	ProSciTech	420SS
Trichloroacetic acide	Sigma-Aldrich	T6399-250g
Trypan Blue stain	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher Scientific	12604013