用于小型细胞处理的自动逆流离心系统
Summary
自动化是电池制造中提高规模和成本管理的关键。本手稿描述了使用逆流离心细胞处理装置实现缓冲液交换和细胞浓度步骤的自动化，用于小规模生物处理。
Abstract
基因和基于细胞的疗法的成功商业化需要具有成本效益和可扩展性的制造过程。缓冲液交换和产品浓缩是大多数制造过程的基本组成部分。但是，在产品开发的早期阶段，这些步骤通常是手动执行的。用于缓冲区交换的手动死端离心是劳动密集型、成本高昂且不可扩展的。封闭的自动化系统可以有效地消除这一费力的步骤，但实施可能具有挑战性。在这里，我们描述了一种新开发的细胞处理设备，它适用于中小型细胞处理，旨在弥合手动处理与大规模自动化之间的差距。通过修改流速和离心速度，可轻松将该协议应用于各种细胞类型和过程。与手动工艺相比，我们的协议演示了高细胞恢复，处理时间更短。从自动化过程中恢复的细胞也保持其增殖率。该器件可作为模块化组件应用于封闭的制造工艺中，以适应缓冲液交换、细胞配方和冷冻保存等步骤。
Introduction
现代医学的格局已经迅速改变，最近发展的基因和细胞为基础的疗法（GCT）。作为翻译研究领域发展最快的领域之一，GCT 行业也面临着独特且前所未有的挑战。除了强大的临床结果外，高效和具有成本效益的制造工艺对于GCT的商业成功至关重要，这在小规模制造1中尤其难以实现。当每批细胞只为一个病人生产几剂，而不是数百或数千次时，时间、劳动力和质量保证的成本被放大了。与异体细胞疗法不同，其制造过程更类似于抗体和重组蛋白的产生，自体细胞疗法通常作为小规模手术1生产。作为生物制药制造中较新的现象，目前小规模细胞加工的选择相当有限。
缓冲液交换对细胞制造至关重要。它是从培养培养体中去除细胞并浓缩用于冷冻保存或输液的下游过程之一。目前，小型细胞制造通常采用与学术研究环境类似的工艺，并依靠专门的洁净室来维持无菌3。手动下游工艺通常使用台式离心机对细胞进行颗粒和重悬浮，以减小体积和交换缓冲液。这些开放式工艺成本高昂（即人工和洁净室维护），制造能力有限，不适合商业生产2、3。
实施自动化已提出作为一种解决方案，以提高制造效率和实现商业规模生产2。在细胞产品中，不能通过用于生物制剂的传统方法（如伽马辐照或终端末端过滤）实现无菌。相反，部署了一个自动封闭系统，以减少污染的风险，操作人员依靠洁净室来维持无菌性。流程自动化还解决了可伸缩性问题，要么让多个系统并行运行（横向扩展），要么增加单个设备的处理能力（向上扩展），从而最大限度地减少操作员之间的可变性。此外，对自体疗法的成本建模分析表明，自动化可以降低制造成本5，6。然而，在一项自动干细胞临床试验中，没有发现任何成本效益，其中使用了7个自动化制造平台，这表明自动化的成本优势可能取决于单个制造过程。
自动化可以引入到现有的制造过程中，有不同的策略。这可以通过实现完全集成的平台或基于模块化的处理链来实现。有几个完全集成的平台可用于自体细胞制造，如CliniMACS神童（米尔滕尼生物泰克），可可（奥克坦生物技术）和量子（特鲁莫BCT）。这些集成平台通常被描述为”一盒 GMP”，对基础设施的要求较低，易于操作。但是，完全集成设置的制造能力可能会受到系统连接的孵化器的限制。例如，神童的培养能力仅限于其400mL室8，量子盒的极限表面积设置为2.1m2（相当于120 T175烧瓶）7，这可能不足以为需要更高细胞剂量9，10的患者。此外，神童和昆腾有一个共同的属性，限制他们的使用：操作单元被一批细胞在整个细胞扩展期间，从而限制了每个单元11可以制造的批次数。模块化自动化方法是创建一个具有多个模块化单元的制造链，以模拟商业制造工艺12、13。这种方法将培养装置与细胞清洗装置分离开来，从而最大限度地提高了制造效率。理想的加工设备是适应和可扩展的制造需求12。
反流离心（CFC）技术，可以追溯到20世纪70年代，在细胞处理方面有着悠久的历史。它通过平衡离心力和反流力来实现细胞浓度和分离。通常，细胞悬浮液在恒定流速下从细胞室的窄端进入，同时受到离心力的影响（图1A）。流体的流动与离心力方向相反。这称为逆流力，在细胞室内形成渐变。反流力则随着细胞室从锥形细胞室尖端变宽而减小。密度越高，直径越大的细胞具有较高的沉降率，因此它们达到向锥形细胞室尖端的力平衡。较小的颗粒可能达到向造型室底部的平衡，或太小，无法保留在腔室中，将被冲走。CFC技术主要以其在加工血液化产品中的应用而闻名，例如为树突状细胞疗法15、16分离单核细胞。在缓冲液交换方面，氟氯化碳技术只应用于大规模制造17，尚未用于小规模的自体细胞疗法制造。
为了满足小型细胞制造需要，最近开发了一种自动化的氟氯化碳装置（见材料表）。自动化细胞处理装置使用逆流离心技术去除细胞碎片，促进缓冲液交换。该设备使用一次性试剂盒进行缓冲交换，该试剂盒可无菌连接到细胞转移袋，从而允许在无菌封闭系统中处理细胞。在这里，我们研究在自动协议中使用逆流离心装置在哺乳动物细胞培养中执行缓冲交换。在这项研究中，我们分别测试了使用Jurkat细胞和美位位细胞（MSCs）的缓冲交换协议，分别对非附着细胞和附着细胞类型进行建模。Jurkat细胞是永生的T细胞，常用于研究急性T细胞白血病19、20。MSCs是成人干细胞，已在人类临床试验中研究过各种疾病9。
Protocol
Representative Results
Discussion
描述的自动缓冲区交换协议简单且用户友好。但是，此协议中有几个关键步骤至关重要，需要特别注意。根据我们的经验，在处理较大的细胞（如 MSC（平均直径 10-15 μm）时，每次运行应至少包括 1 x 107个细胞，以实现最佳细胞恢复（图 4B）。处理较小的细胞，如Jurkat细胞（平均直径为±10μm），需要大约3 x 107个细胞来实现一个稳定的流化细胞床?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到维多利亚州政府运营基础设施支助计划以及经济发展、就业、运输和资源部提供的维多利亚州政府技术券的支持。RL 是国家健康和医学研究委员会职业发展奖学金的获得者。AL 是澳大利亚研究生奖的获得者。
Materials
| 20 ml Luer lock syringes | BD | 302830 |
| 20% Human serum albumin (HSA) | CSL Behring | AUST R 46283 |
| 4-(Dimethylamino)benzaldehyde | Sigma-Aldrich | 156477-25g |
| 500ml IV saline bag | Fresenius Kabi | K690521 |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240112 |
| Automated cell counter (Countess) | Thermo Fisher Scientific | N/A |
| Cell counting chamber slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 |
| Cell stimulation cocktail (500x) | Thermo Fisher Scientific | 00-4970-93 |
| Cell transfer bags | Terumo | T1BBT060CBB |
| CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G3582 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| DMEM: F12 media | Thermo Fisher Scientific | 11320082 |
| EnVision plate Reader | Perkin Elmer | N/A |
| Fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 10099141 |
| Human Interleukin 2 (IL2) Kit | Perkin Elmer | Al221C |
| Luer (female) fittings | CPC | LF41 |
| PC laptop or PC tablet device | ASUS | N/A |
| Plate reader (SpectraMax i3) | Molecular Device | N/A |
| Recombinant Human IFN-γ | PeproTech | 300-02 |
| Rotea counterflow centrifuge cell processing device | Scinogy | N/A |
| Rotea single-use processing kit | Scinogy | N/A |
| RPMI media | Thermo Fisher Scientific | 11875119 |
| Surgical scissors | ProSciTech | 420SS |
| Trichloroacetic acide | Sigma-Aldrich | T6399-250g |
| Trypan Blue stain | Thermo Fisher Scientific | T10282 |
| Trypsin digestion enzyme (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 |
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