Augmentation de la durabilité des cultures de cellules neurales dissociées à l’aide d’une matrice coralline biologiquement active
Summary
La culture cellulaire dissociée de l’hippocampe est un outil expérimental essentiel en neurosciences. La survie et la fonction des cellules neurales en culture sont améliorées lorsque les squelettes coralliniques sont utilisés comme matrices, en raison de leurs rôles neuroprotecteurs et neuromodulateurs. Par conséquent, les cellules neurales cultivées sur la matrice coralline montrent une durabilité plus élevée et sont donc plus adéquates pour la culture.
Abstract
Les cultures de cellules neuronales et gliales hippocampiques dissociées constituent un modèle expérimental précieux pour étudier la croissance et la fonction neuronales en fournissant une isolation cellulaire élevée et un environnement contrôlé. Cependant, la survie des cellules de l’hippocampe in vitro est compromise : la plupart des cellules meurent au cours de la première semaine de culture. Il est donc très important d’identifier des moyens d’augmenter la durabilité des cellules neurales en culture.
Le carbonate de calcium sous forme d’aragonite cristalline dérivée du squelette des coraux peut être utilisé comme matrice supérieure et active pour les cultures neuronales. En nourrissant, protégeant et activant les cellules gliales, le squelette corallien améliore la survie et la croissance de ces cellules in vitro mieux que les autres matrices.
Ce protocole décrit une méthode de culture de cellules hippocampiques sur une matrice corallienne. Cette matrice est générée en attachant des grains de squelettes de corail à des plats de culture, des flacons et des lamelles de verre en verre. Les grains aident à améliorer l’environnement des cellules en les introduisant dans un environnement tridimensionnel fin (3D) pour se développer et former des structures ressemblant à des tissus. L’environnement 3D introduit par le squelette corallien peut être optimisé pour les cellules par broyage, ce qui permet de contrôler la taille et la densité des grains (c’est-à-dire la rugosité de la matrice), une propriété qui s’est avérée influencer l’activité des cellules gliales. De plus, l’utilisation de grains facilite l’observation et l’analyse des cultures, en particulier lors de l’utilisation de la microscopie optique. Par conséquent, le protocole comprend des procédures pour la génération et l’optimisation de la matrice coralline en tant qu’outil pour améliorer la maintenance et la fonctionnalité des cellules neurales in vitro.
Introduction
Les cultures de cellules neurales dissociées, en l’occurrence les cellules hippocampiques, constituent un modèle expérimental précieux pour étudier la croissance et la fonction neuronales en fournissant une isolation et une accessibilité cellulaires élevées 1,2,3. Ce type de culture est fréquemment utilisé en neurosciences, en développement de médicaments et en ingénierie tissulaire en raison de la grande quantité d’informations qui peuvent être collectées, telles que les taux de croissance et de viabilité, la neurotoxicité, la croissance et la mise en réseau des neurites, la connectivité synaptique et la plasticité, les modifications morphologiques, l’organisation et le câblage des neurites, etc.1,4,5,6,7.
Malgré l’importance des cultures, les cellules cultivées sont généralement forcées de se développer sur des lamelles de verre dans une monocouche bidimensionnelle. Ces modifications environnementales strictes diminuent considérablement la capacité des cellules neurales à survivre au fil du temps, car les lamelles de verre sont des substrats non nourrissants avec une faible force d’adhérence, présentant une capacité inférieure à soutenir la croissance cellulaire 8,9,10,11.
Parce que les cellules neurales cultivées sont forcées de croître dans des conditions difficiles, une approche essentielle pour améliorer leur survie serait d’imiter leur environnement naturel autant que possible12,13. Cela pourrait être réalisé en utilisant des biomatériaux qui agiront comme des matrices et imiteront la matrice extracellulaire des cellules, leur permettant de former une structure tissulaire et d’aider à leur alimentation14.
L’utilisation de biomatériaux est une approche prometteuse pour améliorer les cultures cellulaires, car ils agissent comme des échafaudages biocompatibles, assurant la stabilité mécanique et améliorant une variété de propriétés cellulaires, y compris l’adhésion, la survie, la prolifération, la migration, la morphogenèse et la différenciation15,16,17. Plusieurs types de biomatériaux sont utilisés pour améliorer les conditions des cellules in vitro. Parmi eux se trouvent des biopolymères, ou composants biologiques qui font généralement partie de la matrice extracellulaire des cellules. Ces biomatériaux sont principalement utilisés comme forme d’agents d’enrobage polymérisés ou d’hydrogels18,19,20. D’une part, les matrices mentionnées ci-dessus donnent aux cellules un environnement 3D familier pour se développer, favorisent leur adhésion à la capsule et leur donnent un soutien mécanique21,22. D’autre part, leur forme polymérisée et le confinement des cellules dans les hydrogels perturbent l’accès des cellules aux composants nourriciers présents dans le milieu de croissance et rendent également plus difficile le suivi des cellules par des méthodes microscopiques23.
Les exosquelettes coralliens sont des matrices biologiques d’origine marine. Ils sont faits de carbonate de calcium, ont une stabilité mécanique et sont biodégradables. Des études antérieures utilisant le squelette de corail comme matrice pour la croissance de cellules neurales en culture ont montré une adhésion beaucoup plus grande, par rapport aux lamelles de couvertureen verre 24,25. De plus, les cellules neurales cultivées sur le squelette de corail ont démontré leur capacité à absorber le calcium dont le squelette est composé, ce qui protège les cellules neurales dans des conditions de privation de nutriments26. De plus, le squelette corallien est une matrice de soutien et de soutien qui augmente la survie des cellules neurales, encourage la formation de réseaux neuronaux, élève le taux de connectivité synaptique et permet la formation de structures tissulaires27,28. Des études récentes ont également montré que la topographie de surface de la matrice du squelette corallien joue un rôle crucial dans la distribution et l’activation des cellules gliales 8,29. En outre, le squelette de corail est efficace comme matrice pour la culture d’autres types de cellules, tels que les ostéocytes30,31, les hépatocytes et les cardiomyocytes en culture (données non publiées).
Par conséquent, le squelette de corail est une matrice prometteuse pour la culture de cellules in vitro. Ainsi, le protocole détaillé ci-dessous décrit la technique de culture de cellules neurales sur squelette de corail pour produire des cultures neuronales plus stables et prospères que celles obtenues par les méthodes existantes. Ce protocole peut également être utile pour la culture de cardiomyocytes, d’hépatocytes et d’autres types de cellules.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique présentée ici décrit un moyen d’améliorer le maintien et la fonctionnalité des cellules neurales en culture. Ceci est réalisé en adhérant les cellules à une matrice faite de grains de squelette de corail qui nourrit les cellules et favorise leur croissance et leur activité. L’utilisation de cette technique augmente la capacité du modèle de culture neuronale à imiter l’environnement des cellules dans le cerveau.
L’introduction de la matrice en tant que substrat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par le programme KAMIN du ministère israélien du Commerce et du Travail et par Qrons Inc., 777 Brickell Avenue Miami, FL 33131, États-Unis.
Materials
| 24-well plates | Greiner | #60-662160 | |
| B-27 | Gibco | #17504-044 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | #A4503 | |
| D – glucose | Sigma | #G8769 | |
| Dulbecco's Minimal Essential Eagle (DMEM) | Sigma | #D5796 | |
| Electrical sieve | Ari Levy | #3700 | |
| Fetal Bovine Serun (FBS) | Biological Industries | #04-007-1A | |
| First Day Medium | 85.1% Minimum Essential Eagle’s medium (MEM), 11.5% heat-inactivated fetal bovine serum, 1.2% L-Glutamine and 2.2% D-Glucose. | ||
| Flasks | Greiner | #60-690160 | 25cm^2, Tissue culture treated |
| Fluoro-deoxy-uridine | Sigma | #F0503 | |
| Glass Coverslips | Menzel-Glaser | #BNCB00120RA1 | |
| H2O2 | Romical | #007130-72-19 | Hazardous |
| Ham's F-12 Nutrient Mixture | Sigma | #N4888 | |
| HANK'S solution | Sigma | #H6648 | |
| Kynurenic acid | Sigma | #K3375 | |
| L – glutamine | Sigma | #G7513 | |
| Manual strainer (40µm) | VWR | #10199-654 | |
| Minimun Essential Eagle (MEM) | Sigma | #M2279 | |
| Mortar and pestle | De-Groot | 4-P090 | |
| NaClO (Sodium Hypochlorite) | Sigma | #425044 | Hazardous |
| NaOH | Sigma | #S8045 | Hazardous |
| Neuronal Growth Medium | 45% MEM, 40% Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), 10% Nutrient mixture F-12 Ham, 0.25% (w/v) bovine serum albumin (BSA), 0.75% D-glucose, 0.25% L-Glutamine, 0.5% B-27 supplement, 0.1% kynurenic acid, 0.01% of 70 % uridine and 30% fluoro-deoxy-uridine. | ||
| Petri dish | Greiner | #60-628160, #60-627160 | 60mm, 35mm, respectively. |
| Poly D – Lysine | Sigma | #P7280 | |
| Smart Dentin Grinder | KometaBio | #GR101 | |
| Trypsin | Gibco | #15-090-046 | |
| Uridine | Sigma | #U3750 |
Referências
- Pan, L., et al. An in vitro method to manipulate the direction and functional strength between neural populations. Frontiers in Neural Circuits. 9, 32 (2015).
- Wellbourne-Wood, J., Chatton, J. Y. From Cultured Rodent Neurons to Human Brain Tissue: Model Systems for Pharmacological and Translational Neuroscience. ACS Chemical Neuroscience. 9 (8), 1975-1985 (2018).
- Molnár, E. Long-term potentiation in cultured hippocampal neurons. Seminars in Cell & Developmental Biology. 22 (5), 506-513 (2011).
- Silva, R. F. M., et al. Dissociated primary nerve cell cultures as models for assessment of neurotoxicity. Toxicology Letters. 163 (1), 1-9 (2006).
- Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An Overview of in vitro Methods to Study Microglia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, (2018).
- Ogata, N., Tatebayashi, H. Primary culture of mammalian brain neurons and its application to patch-clamp recording. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 98 (4), 245-250 (1991).
- Lonchamp, E., Dupont, J. L., Beekenkamp, H., Poulain, B., Bossu, J. L. The mouse cerebellar cortex in organotypic slice cultures: an in vitro model to analyze the consequences of mutations and pathologies on neuronal survival, development, and function. Critical Reviews in Neurobiology. 18 (1-2), 179-186 (2006).
- Weiss, O. E., et al. Modulation of scar tissue formation in injured nervous tissue cultivated on surface-engineered coralline scaffolds. Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. , (2017).
- Chen, J., Herrup, K. Selective vulnerability of neurons in primary cultures and in neurodegenerative diseases. Reviews in the Neurosciences. 19 (4-5), 317-326 (2008).
- Potter, S. M., DeMarse, T. B. A new approach to neural cell culture for long-term studies. Journal of Neuroscience Methods. 110 (1-2), 17-24 (2001).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. General considerations for live imaging of developing hippocampal neurons in culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), 312-318 (2012).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D Glial Cell Culture Systems and Applications for Neurodegeneration and Neuroinflammation. SLAS discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 583-601 (2017).
- Karimi, M., et al. Microfluidic systems for stem cell-based neural tissue engineering. Lab on a Chip. 16 (14), 2551-2571 (2016).
- Murphy, A. R., Laslett, A., O’Brien, C. M., Cameron, N. R. Scaffolds for 3D in vitro culture of neural lineage cells. Acta Biomaterialia. 54, 1-20 (2017).
- Walker, P. A., et al. Advances in Progenitor Cell Therapy Using Scaffolding Constructs for Central Nervous System Injury. Stem Cell Reviews. 5 (3), 283-300 (2009).
- Pettikiriarachchi, J. T. S., Parish, C. L., Shoichet, M. S., Forsythe, J. S., Nisbet, D. R. Biomaterials for Brain Tissue Engineering. Australian Journal of Chemistry. 63 (8), 1143-1154 (2010).
- Lu, T., Li, Y., Chen, T. Techniques for fabrication and construction of three-dimensional scaffolds for tissue engineering. International Journal of Nanomedicine. 8, 337-350 (2013).
- Maclean, F. L., Rodriguez, A. L., Parish, C. L., Williams, R. J., Nisbet, D. R. Integrating Biomaterials and Stem Cells for Neural Regeneration. Stem Cells and Development. 25 (3), 214-226 (2016).
- Drury, J. L., Mooney, D. J. Hydrogels for tissue engineering: scaffold design variables and applications. Biomaterials. 24 (24), 4337-4351 (2003).
- Woerly, S., Marchand, R., Lavallée, G. Intracerebral implantation of synthetic polymer/biopolymer matrix: a new perspective for brain repair. Biomaterials. 11 (2), 97-107 (1990).
- Dillon, G. P., Yu, X., Sridharan, A., Ranieri, J. P., Bellamkonda, R. V. The influence of physical structure and charge on neurite extension in a 3D hydrogel scaffold. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 9 (10), 1049-1069 (1998).
- Carballo-Molina, O. A., Velasco, I. Hydrogels as scaffolds and delivery systems to enhance axonal regeneration after injuries. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- George, J., Hsu, C. C., Nguyen, L. T. B., Ye, H., Cui, Z. Neural tissue engineering with structured hydrogels in CNS models and therapies. Biotechnology Advances. , (2019).
- Shany, B., et al. Aragonite crystalline biomatrices support astrocytic tissue formation in vitro and in vivo. Tissue Engineering. 12 (7), 1763-1773 (2006).
- Baranes, D., López-García, J. C., Chen, M., Bailey, C. H., Kandel, E. R. Reconstitution of the hippocampal mossy fiber and associational-commissural pathways in a novel dissociated cell culture system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4706-4711 (1996).
- Peretz, H., Talpalar, A. E., Vago, R., Baranes, D. Superior survival and durability of neurons and astrocytes on 3-dimensional aragonite biomatrices. Tissue Engineering. 13 (3), 461-472 (2007).
- Shany, B., Vago, R., Baranes, D. Growth of primary hippocampal neuronal tissue on an aragonite crystalline biomatrix. Tissue Engineering. 11 (3-4), 585-596 (2005).
- Baranes, D., et al. Interconnected network of ganglion-like neural cell spheres formed on hydrozoan skeleton. Tissue Engineering. 13 (3), 473-482 (2007).
- Morad, T. I., et al. Gliosis of astrocytes cultivated on coral skeleton is regulated by the matrix surface topography. Biomedical Materials. 14 (4), 045005 (2019).
- Green, D. W., et al. A Therapeutic Potential for Marine Skeletal Proteins in Bone Regeneration. Marine Drugs. 11 (4), 1203-1220 (2013).
- Neto, A. S., Ferreira, J. M. F. Synthetic and Marine-Derived Porous Scaffolds for Bone Tissue Engineering. Materials. 11 (9), (2018).
- Ahmad Khalili, A., Ahmad, M. R. A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications. International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).
- . Visualization of the ultrastructural interface of cells with the outer and inner-surface of coral skeletons Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19218486 (2019)
- Drake, J. L. Proteomic analysis of skeletal organic matrix from the stony coral Stylophora pistillata. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (10), 3788-3793 (2013).
- Ramos-Silva, P., et al. The skeletal proteome of the coral Acropora millepora: the evolution of calcification by co-option and domain shuffling. Molecular Biology and Evolution. 30 (9), 2099-2112 (2013).
- Peretz, H., Blinder, P., Baranes, D., Vago, R. Aragonite crystalline matrix as an instructive microenvironment for neural development. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2 (8), 463-471 (2008).
- Morad, T. . CaCO3 Matrix Dictates Astrocytes Transition to Astrogliosis. , (2019).
- Prada, F., et al. Ocean warming and acidification synergistically increase coral mortality. Scientific Reports. 7, (2017).
