JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Monopolar Mitotik İğlerde Dönen Disk Mikroskobu ile Mikrotübül Dinamiğinin Ölçülmesi

Published: November 15, 2019
doi:
10.3791/60478
,
1AG Oncophysiology,Max-Planck Institute of Experimental Medicine, 2Göttingen Graduate School for Neurosciences, Biophysics, and Molecular Biosciences (GGNB)

Summary

Burada canlı hücre dönen disk konfokal mikroskopisi ve MATLAB tabanlı görüntü işleme kullanarak prometafazda senkronize hücrelerde mikrotübül dinamiği analizinin sağlam ve ayrıntılı bir yöntemini sıyoruz.

Abstract

Canlı hücrelerdeki mikrotübül dinamiklerini belirlemek için kurulmuş bir yöntemin modifikasyonunu tanımlıyoruz. Protokol, mikrotübüllerin pozitif uçları (tdTomato floresan proteini ile etiketlenmiş EB3) ve dönen disk konfokal mikroskopisi kullanılarak yüksek hızlı, yüksek çözünürlüklü, canlı hücre görüntülemesi için genetik olarak kodlanmış bir belirteç ifadesine dayanmaktadır. Hücre döngüsü senkronizasyonu ve mikrotübüllerin artan yoğunluğu mitotik hücrelerde sentozomal ayırma inhibe ederek elde edilir ve büyüme analizi açık kaynak U-Track yazılımı kullanılarak gerçekleştirilir. Parlak ve kırmızı yayılılmış floresan proteinin kullanımı, düşük lazer gücü ve iplik disk mikroskobu için gerekli azaltılmış maruz kalma süresi ile birlikte fototoksisiteyi ve ışığa bağlı objelerin olasılığını azaltır. Bu standart kültür koşulları altında bir büyüme ortamda hücreleri korurken aynı hazırlık hücrelerin daha fazla sayıda görüntüleme sağlar. Analiz denetlenen otomatik bir şekilde yapıldığından, sonuçlar istatistiksel olarak sağlam ve tekrarlanabilir.

Introduction

Mikrotübüller (MTs) hemen hemen tüm ökaryotik hücrelerde ve bazı bakterilerde bulunan son derece dinamik yapılardır1. Aktin ve ara filamentlerle birlikte sitoiskelet2,3′ün yonttürün. Hücre bölünmesi4, molekül taşıma5, flagellar dayak6, birincil cilium7ile çevrenin hissi , işitme (kinocilium)8,9, embriyogenez10,11,12, invazyon ve metastaz13,14, ve hatta bellek oluşumu15,16,17,18, ve diğer pek çok süreç öncelikle MTs güveniyor. Tüm bu olaylara MTs katılımı hızla büyüme (polimerizasyon) ve büzülme (depolimerizasyon) arasında geçiş olağanüstü yeteneği olmadan imkansız olacaktır. Bu özellik dinamik kararsızlık19olarak tanımlanır. MT dinamikliği birçok patolojik koşullarda değiştirilir20,21,22. Bu nedenle, bu özelliğin doğasını belirleme hastalık mekanizmaları ve daha sonra tedavi anlamak için yardımcı olabilir.

MT dinamiği analizi için uzun bir yöntem listesi geliştirilmiştir ve bunların çoğu görüntüleme tekniklerine dayanmaktadır23. Başlangıçta, geniş alan ışık mikroskoplar in vitro24tubulin polimerlerin oluşumunu gözlemlemek için kullanılmıştır. MT artı uçlarında toplanan son bağlayıcı (EB)-proteinlerin keşfi ve floresan etiket proteinleri için yöntemlerin geliştirilmesi, geniş alan ve konfokal floresan mikroskoplar25,26,27ile canlı hücrelerde doğrudan MT’lerin davranışını gözlemlemek mümkün kılmaktadır. Bir EB-protein ilerler bağlayıcı protein 3 (EB3)28; bir floresan protein erimiş EB3 aşırı ekspresyon ve izleme ile, MT artı uç montaj oranlarıbelirlenebilir 29,30.

Konfokal lazer tarama floresan mikroskopisi (CLSM) sıklıkla MT dinamiklerini takip etmek için kullanılır. Ancak, bu görüntüleme tekniği fototoksisite ve fotobeyazrlama, canlı hücre ve loş örnek görüntüleme için iki istenmeyen süreçler yüksek bir risk teşkil31. Daha iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, lazer gücü ve maruz kalma süresi numunelere zarar vermezken yeterince yüksek olmalıdır ve bu da hız karşılığında çözünürlükten ödün vermelidir. CLSM’ye uygun bir alternatif, dönen disk mikroskobu32’dir. Bu görüntüleme yöntemi bir Nipkow disk33kullanımına dayanmaktadır , hangi iğne delikleri bir dizi taşıyan hareketli bir disk oluşur, ve aynı anda aynı örneği görüntüleme birçok CLS mikroskoplar eşdeğer çalışır34. Bu nedenle, lazerden gelen ışık aynı anda örnekteki çeşitli bölgeleri aydınlatır ancak konfokal tabiatı korur. Nipkow disk, bu nedenle, CLSM benzer ama daha hızlı ve daha az lazer gücü kullanarak görüntüleri elde sağlar. Nipkow disk daha yokogawa Electric tarafından geliştirilmiştir, hangi mikrolensler bir dizi ile ikinci bir disk tanıttı bu ayrı ayrı bir iğne deliği içine ışık doğrudan, daha fazla fototoksisite ve fotobleaching azaltarak35. Böylece, dönen disk lazer tarama mikroskopisi canlı hücre görüntüleme için tercih edilen bir yöntem haline geldi, ve mümkün yüksek hızda yüksek sinyal-gürültü oranı ile görüntü elde etmek için yapar31,36, bu hızlı büyüyen MT biter gibi sinyalleri çözmek için çok önemlidir.

MT dinamiği geçici olarak farklılık gösterir. Örneğin, mitotik MTs interfaz olanlar37,38daha dinamiktir. Benzer şekilde, büyüme hızı ve büzülme farklılıkları aynı hücre döngüsü fazı içinde bile gözlenmiştir, mitoz gibi39,40. Bu nedenle, yanlış veri toplamayı önlemek için, MT dinamiğinin ölçümü hücre döngüsü sırasında dar bir zaman penceresi ile sınırlandırılmalıdır. Örneğin, prometafazda MT dinamiğinin ölçümü, motor kinsin Eg541’i inhibe eden ve bipolar mitotik mil oluşumunu engelleyen bir monastrol analogu olan dimethylenastron (DME) hücreleri tedavi ederek elde edilebilir42. Eg5 inhibitörü DME ve diğer monastrol türevleri ile prometafazda hücrelerin inhibisyonu MT dinamikleri etkilemez43,44,45, Hangi DME sabit ve canlı hücrelerde hem de MT dinamikleri incelemek için yararlı bir araç yapar44.

Burada Ertych ve ark.44 tarafından tanımlanan prometafaz hücrelerinde MT dinamiği analizi yöntemini çift dönen disk görüntüleme ile birleştiriyoruz. Bu yöntem, fotobeyaztma ve minimum fototoksisite olmaksızın, daha yüksek görüntüleme hızına sahip tek bir odak düzleminden toplanan prometafaz hücrelerinde MT dinamiğinin ölçülmesine olanak sağlar. Ayrıca, floresan muhabiri olarak, yeşil floresan protein (EGFP) ile karşılaştırıldığında parlaklık ve fotostabilite geliştirilmiş ve daha düşük enerjiLi ışık ile heyecanlı tandem dimer Domates floresan protein (tdTomato) kullanın46. Bu nedenle, tdTomato uyarma için daha az lazer gücü gerektirir ve daha az fototoksik. Toplamda, fototoksisiteyi azaltarak ve MT dinamikanalizi için gerekli olan çözünürlüğü ve postprocessingi iyileştirerek yöntemi daha da geliştiriyoruz. Ayrıca, diğer senkronizasyon teknikleri ile birleştirerek yöntemin gelecekteki değişiklikler için bir temel oluşturmak.

Protocol

1. HeLa Hücrelerinin Tohumlanması Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 2 mL 5 μg/mL fibronectin çözeltisi hazırlayın ve 4 iyi odalı coverslip ‘in her kuyuya 450 μL ekleyin (#1.5). 37 °C ve %5 CO2’de15 dakika boyunca kaydırağı kuluçkaya yatırın. Dulbecco’nun Fosfat Tamponlu Salini (DPBS) ile eş zamanlı olarak büyüyen HeLa hücrelerini durulayın ve tripsin-EDTA ile inkübün (%0.05: 0.02; w:v) 5 dakika boyunca 37 °C’de. Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 orta 3:1…

Representative Results

Şekil 1A’daözetlenen protokolütaki pEB3-tdTomato plazmid, eş zamanlı olarak büyüyen HeLa hücrelerinde geçici olarak ifade edildi. DME tedavisi ile prometafazda transfeksiyon dan sonra hücreler 48 saat senkronize edildi(Şekil 1B). Bu adım, MT dinamiğinin ölçümünün her zaman hücre döngüsünün aynı aşamasında yapılmasını sağlamıştır. Zaman atlamalı filmler daha fazla işlenmiş ve U-Track v2.2.0 ile analiz olarak ek belgelerde açı…

Discussion

Burada, ilk ertych ve ark.44tarafından kurulan bir yöntemin bir değişiklik açıklar. Diğer bazı modifikasyonlarla birlikte, bu MT dinamiği analizi tekniğini çift dönen disk konfokal görüntüleme ile birleştiriyoruz. Çift eğirme diskinin kullanımı fototoksisiteyi azaltırken mt’ler büyüyen çözünürlüğü artırır36. Daha uzun bir dalga boyu floresan muhabirine geçerek hücrelerin fotobeyaztma ve lazer ışık kaynaklı hasarını daha da azaltıyoru…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Max-Planck Deneysel Tıp Enstitüsü Hafif Mikroskobu Tesisi üyelerine uzman tavsiye ve desteklerinden dolayı teşekkür ederiz.

Materials

Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29 (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43 (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport – basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4 (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357 (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10 (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171 (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130 (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28 (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8 (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36 (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62 (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. . Methods in Molecular Biology. , (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38 (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7 (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5 (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20 (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62 (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85 (1), 39 (2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy — a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27 (5), 349-355 (2002).
  33. Nipkow, P. Elektrisches teleskop. Germany patent. , (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34 (25), 5695-5698 (1995).
  35. Tanaami, T., Kenta, M. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. , (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -. M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198 (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12 (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59 (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286 (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150 (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16 (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182 (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120 (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00 (1), 3 (1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33 (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D’Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. , e52138 (2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26 (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16 (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11 (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44 (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -. S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100 (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92 (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36 (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20 (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).

Tags

Keywords: Microtubule DynamicsSpinning Disk MicroscopyMonopolar Mitotic SpindlesFluorescent ProteinPhototoxicityEB3TrypsinizationHeLa CellsTransfectionDimethylenastron (DME)
check_url/pt/60478?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image