Identificación de caminos de huésped dirigidos por proteínas de efector bacteriano utilizando la toxicidad de levadura y las pantallas supresoras
Summary
Los patógenos bacterianos secretan proteínas en el huésped que se dirigen a procesos biológicos cruciales. Identificar las vías del huésped a las que se dirigen las proteínas efectoras bacterianas es clave para abordar la patogénesis molecular. Aquí, se describe un método que utiliza un supresor de levadura modificado y una pantalla de toxicidad para dilucidar las vías huésped dirigidas por proteínas efectoras bacterianas tóxicas.
Abstract
Las bacterias intracelulares secretan factores de virulencia llamados proteínas efectoras en el citosol huésped que actúan para subvertir las proteínas huésped y/o sus vías biológicas asociadas en beneficio de la bacteria. La identificación de proteínas efectoras bacterianas putativas se ha vuelto más manejable debido a los avances en la secuenciación del genoma bacteriano y la llegada de algoritmos que permiten en silico la identificación de genes que codifican candidatos a la secreción y/o eucariotas Dominios. Sin embargo, la identificación de estos importantes factores de virulencia es sólo un paso inicial. Naturalmente, el objetivo es determinar la función molecular de las proteínas efectoras y dilucidar cómo interactúan con el huésped. En los últimos años, técnicas como la pantalla dos híbridas de levadura y las inmunoprecipitaciones a gran escala, junto con la espectrometría de masas, han ayudado a identificar interacciones proteína-proteína. Aunque la identificación de un socio de unión huésped es el primer paso crucial para dilucidar la función molecular de una proteína efector bacteriana, a veces se encuentra que la proteína huésped tiene múltiples funciones biológicas (por ejemplo, actina, clathrin, tubulina), o la proteína bacteriana puede no unir físicamente las proteínas huésped, privando al investigador de información crucial sobre la vía exacta del huésped que se está manipulando. Se ha adaptado una pantalla de toxicidad por levadura modificada junto con una pantalla supresora para identificar las vías del huésped afectadas por las proteínas efectoras bacterianas. La pantalla de toxicidad se basa en un efecto tóxico en la levadura causado por la proteína efectora que interfiere con las vías biológicas del huésped, que a menudo se manifiesta como un defecto de crecimiento. La expresión de una biblioteca genómica de levadura se utiliza para identificar factores de huésped que suprimen la toxicidad de la proteína efectora bacteriana y así identificar proteínas en la vía a la que se dirige la proteína efector. Este protocolo contiene instrucciones detalladas tanto para las pantallas de toxicidad como para las pantallas supresoras. Estas técnicas se pueden realizar en cualquier laboratorio capaz de clonación molecular y cultivo de levadura y Escherichia coli.
Introduction
El primer informe de procedimientos similares a los aquí presentados caracterizó al efector de la Legionella pneumophila tipo IV SidD, una deAMPylase que modifica Rab11. Se utilizaron técnicas comparables para la caracterización de varios efectores L. pneumophila 1,2,3. El ensayo fue adaptado para caracterizar una proteína efectora Coxiella burnetii tipo IV4,y recientemente la utilidad de esta técnica se amplió para la caracterización de las proteínas de membrana de inclusión de Chlamydia trachomatis 5 .
Este protocolo se puede dividir en dos partes principales: 1) la pantalla de toxicidad de la levadura, en la que la proteína del efector bacteriano de interés se expresa en la levadura y los clones se examinan para detectar un fenotipo tóxico como lo demuestra un defecto de crecimiento, y 2) la pantalla supresora de levadura , en el que el fenotipo tóxico se suprime mediante la expresión de una biblioteca genómica de levadura en la cepa tóxica. Por lo tanto, la pantalla de toxicidad es una pantalla para fenotipos tóxicos que se manifiestan como defectos de crecimiento cuando el efector bacteriano de interés está sobreexpresado. Los clones tóxicos, transformados con éxito y la expresión del efector bacteriano, se seleccionan y guardan para el siguiente paso. El segundo paso importante consiste en sobreexpresar una biblioteca genómica de levadura parcialmente digerida en el clon de levadura tóxica. Los plásmidos que componen la biblioteca genómica de levadura sugerida para su uso en este protocolo llevan inserciones de 5 a 20 kb, generalmente correspondientes a 3 x 13 marcos de lectura abierta de levadura (ORF) de un tamaño medio de gen de 1,5 kb en todos los plásmidos, representando todo el genoma de levadura cubierto cubierto aproximadamente 10veces. Esta parte del ensayo se llama la pantalla supresora, ya que el objetivo es suprimir la toxicidad de la proteína efector bacteriana. Los posibles plásmidos supresores están aislados de la levadura, secuenciados y los ORF supresores identificados. La razón que subyace a la pantalla supresora es que la proteína del efector se une, interactúa y/o abruma los componentes de la vía huésped a la que se dirige, y que proporcionar esas proteínas huésped en exceso puede rescatar el efecto tóxico en la vía y, por lo tanto, el defecto de crecimiento. Por lo tanto, los ORF identificados que suprimen la toxicidad a menudo representan a múltiples participantes de una vía huésped. A continuación, se realizan experimentos ortogonales para verificar que el efector bacteriano interactúa de hecho con la vía implicada. Esto es especialmente necesario si se ha identificado un socio de unión como clathrin o actina, ya que estas proteínas están implicadas en una multitud de procesos de huésped. Otros experimentos pueden elucidar la función fisiológica de la proteína efector durante la infección. Las pantallas de toxicidad y supresor son también potentes herramientas para descifrar la función fisiológica de las proteínas efectoras bacterianas que no unen físicamente las proteínas huésped con afinidades suficientes para detectar por inmunoprecipitación o que interactúan con la host en interacciones enzimáticas de hit-and-run que pueden no ser detectados por una pantalla híbrida de levadura dos.
Aunque la pantalla supresora puede ser un método potente para revelar posibles interacciones fisiológicas entre las proteínas efectoras bacterianas y las vías del huésped, la proteína efectora bacteriana debe inducir un defecto de crecimiento en la levadura, de lo contrario usarlo en el pantalla supresor será de poca utilidad. Además, el fenotipo tóxico debe resultar en al menos un déficit de 2 a 3registros 10 en crecimiento o será difícil identificar supresores. Si se configura un laboratorio para el cultivo celular, el cribado de proteínas efectoras para la toxicidad en líneas celulares comunes como HeLa a menudo puede dar una idea de si vale la pena el esfuerzo para proceder con la pantalla de toxicidad de la levadura. La expresión ectópica de la proteína efector en las células de HeLa a veces resulta en toxicidad que se correlaciona muy fuertemente con la toxicidad en la cepa de levadura utilizada para estas pantallas4. Las características notables del estrés en las células de HeLa incluyen la pérdida de fibras de tensión, el desprendimiento celular de la placa y la condensación nuclear que indica apoptosis. Cualquier indicación visual de estrés en las células de HeLa hace que la proteína de interés sea un buen candidato para inducir un defecto de crecimiento en la levadura, que se replica namucho más rápidamente y por lo tanto son más sensibles a la perturbación de las vías esenciales.
Cabe señalar que la pantalla del supresor no siempre identifica a los socios de unión de host como supresores, pero todavía puede implicar componentes críticos de la(s) vía(s) del huésped(s) objetivo(es), lo que produce una visión holística de los procesos biológicos que está secuestrando el proteína efector bacteriana. En la superficie, esto parece contraintuitivo, porque proporcionar el socio de unión de la proteína efector en exceso se espera que rescate el defecto de crecimiento. En los esfuerzos por identificar vías dirigidas por la proteína efector C. trachomatis CT229 (CpoS), que se une a al menos 10 GTPases Rab diferentes durante la infección5, ninguno de los socios de unión de Rab suprimió la toxicidad de CT229. Sin embargo, se identificaron numerosos supresores involucrados en el tráfico de vesículas recubiertas de clathrin ( CCV), lo que llevó a seguir trabajando demostrando que el CT229 subvierte específicamente el tráfico de CCV dependiente de Rab. Del mismo modo, al investigar la proteína efector C. burnetii Cbu0041 (CirA) se identificaron varias Rho GTPases que rescataron el defecto de crecimiento de la levadura, y más tarde se encontró que CirA funciona como una proteína activadora GTPase (GAP) para RhoA4.
La utilidad de la pantalla supresora de levadura para esclarecer las vías del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas no se puede exagerar, y otros investigadores que intentan caracterizar las proteínas efectoras bacterianas intracelulares pueden beneficiarse en gran medida estas técnicas. Estos ensayos son de valor si las inmunoprecipitaciones y/o las pantallas híbridas de levadura dos no han encontrado un compañero de unión y pueden dilucidar qué vías son atacadas por la proteína efectora bacteriana. Aquí, se proporcionan protocolos detallados para la toxicidad y las pantallas supresoras para identificar las vías biológicas del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas intracelulares, así como algunos de los obstáculos comunes experimentados al usar estos ensayos y sus soluciones correspondientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe los procedimientos paso a paso para identificar las vías biológicas del huésped dirigidas por las proteínas efectoras bacterianas utilizando una pantalla de toxicidad y supresor de levadura modificada. La cepa de levadura utilizada, S. cerevisiae W303, es auxotravófica tanto para uracilo como para leucina. La auxotrofia Uracil de la cepa se utiliza para seleccionar levaduras portadoras de la proteína de interés en el vector pYesNTA-Kan, mientras que la auxotrofia de leucina se util…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Shelby Andersen, Abby McCullough y Laurel Woods por su ayuda con estas técnicas. Este estudio fue financiado con fondos de startups del Departamento de Microbiología e Inmunología de la Universidad de Iowa a Mary M. Weber.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
Referências
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