Identificazione dei percorsi host mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando la tossicità del lievito e gli schermi soppressori
Summary
I patogeni batterici secernono proteine nell’ospite che prendono di mira processi biologici cruciali. Identificare le vie host mirate alle proteine degli effetti batterici è fondamentale per affrontare la patogenesi molecolare. Qui, viene descritto un metodo che utilizza un soppressore di lievito modificato e uno schermo di tossicità per chiarire le vie dell’ospite mirate alle proteine degli efettori batterici tossici.
Abstract
I batteri intracellulari secernono fattori di virulenza chiamati proteine eftraenti nel citosol ospite che agiscono per sovvertire le proteine ospiti e/o i loro percorsi biologici associati a beneficio del batterio. L’identificazione delle proteine degli effetti batterici putativi è diventata più gestibile grazie ai progressi nel sequenziamento del genoma batterico e all’avvento di algoritmi che consentono l’identificazione in silico dei geni che codificano i candidati alla secrezione e/o quelli eucarioti Domini. Tuttavia, l’identificazione di questi importanti fattori di virulenza è solo un primo passo. Naturalmente, l’obiettivo è quello di determinare la funzione molecolare delle proteine efmarcatori e chiarire come interagiscono con l’ospite. Negli ultimi anni, tecniche come lo schermo bi-ibrido del lievito e le immunoprecipitazioni su larga scala accoppiate con la spettrometria di massa hanno aiutato nell’identificazione delle interazioni proteina-proteina. Sebbene l’identificazione di un partner di legame ospite sia il primo passo fondamentale per chiarire la funzione molecolare di una proteina efmarcatore batterica, a volte la proteina ospite si trova ad avere molteplici funzioni biologiche (ad esempio, actina, clathrin, tubulina), o la proteina batterica non può legare fisicamente le proteine ospiti, privando il ricercatore di informazioni cruciali sulla precisa via ospite manipolata. È stato adattato uno screening di tossicità del lievito modificato abbinato a uno schermo soppressore per identificare le vie dell’ospite influenzate dalle proteine degli effetti batterici. Lo schermo di tossicità si basa su un effetto tossico nel lievito causato dalla proteina efcontadina che interferisce con i percorsi biologici ospiti, che spesso si manifesta come un difetto di crescita. L’espressione di una libreria genomica del lievito viene utilizzata per identificare i fattori ospiti che sopprimono la tossicità della proteina degli effetti batterici e quindi identificano le proteine nel percorso che la proteina esecutore prende di mira. Questo protocollo contiene istruzioni dettagliate sia per le schermate di tossicità che per le schermate di soppressore. Queste tecniche possono essere eseguite in qualsiasi laboratorio in grado di clonazione molecolare e coltivazione di lievito ed Escherichia coli.
Introduction
Il primo rapporto di procedure simili a quelle qui presentate ha caratterizzato l’effetto della legionella pneumophila di tipo IV SidD, una deAMPylase che modifica Rab11. Tecniche comparabili sono state utilizzate per la caratterizzazione di diversi effetti L. pneumophila 1,2,3. Il saggio è stato adattato per caratterizzare una proteina effettore Coxiella burnetii tipoIV 4, e recentemente l’utilità di questa tecnica è stata ampliata per la caratterizzazione delle proteine della membrana di inclusione della Chlamydia trachomatis 5 .
Questo protocollo può essere suddiviso in due parti principali: 1) lo schermo di tossicità del lievito, in cui la proteina dell’effettore batterico di interesse è espressa in lievito e i cloni vengono sottoposti a screening per un fenotipo tossico come evidenziato da un difetto di crescita, e 2) lo schermo soppressore del lievito , in cui il fenotipo tossico viene soppresso dall’espressione di una libreria genomica del lievito nel ceppo tossico. Pertanto, lo schermo di tossicità è uno schermo per i fenotipi tossici che si manifestano come difetti di crescita quando l’effetto batterico di interesse è sovraespresso. I cloni tossici, trasformati con successo ed esprimendo l’effettore batterico, vengono selezionati e salvati per la fase successiva. Il secondo passo importante consiste nell’esprimere sovraesprimenza di una libreria genomica di lievito parzialmente digerito nel clone del lievito tossico. I plasmidi che compongono la libreria genomica del lievito suggerita per l’uso in questo protocollo trasportano inserti da 5,20 kb, di solito corrispondenti a 3-13 telai di lettura aperti di lievito (ORF) di una dimensione media del gene di 1,5 kb su tutti i plasmidi, che rappresentano l’intero genoma del lievito coperto circa 10x. Questa parte del saggio è chiamata lo schermo del soppressore, in quanto l’obiettivo è sopprimere la tossicità della proteina dell’effettore batterico. I potenziali plasmidi soppressori sono isolati dal lievito, sequenziati e gli ORF soppressori identificati. La logica alla base dello schermo soppressore è che la proteina eflatrice si lega, interagisce e/o travolge i componenti del percorso host a cui si rivolge, e che fornire le proteine ospiti in eccesso può salvare l’effetto tossico sul percorso e quindi, il difetto di crescita. Pertanto, gli ORF identificati che sopprimono la tossicità spesso rappresentano più partecipanti di un percorso host. Vengono quindi eseguiti esperimenti ortogonali per verificare che l’effettuatore batterico interagisca effettivamente con il percorso implicato. Ciò è particolarmente necessario se è stato identificato un partner di legame come clathrin o actin, perché queste proteine sono coinvolte in una moltitudine di processi host. Ulteriori esperimenti possono quindi chiarire la funzione fisiologica della proteina dell’effettore durante l’infezione. Gli schermi di tossicità e soppressore sono anche potenti strumenti per decifrare la funzione fisiologica delle proteine degli effetti batterici che non legano fisicamente le proteine ospiti con affinità sufficienti da rilevare per immunoprecipitazioni o che interagiscono con il ospite in interazioni eseguito e con hit-and-run enzimatiche che potrebbero non essere rilevate da uno schermo ibrido yeast-two.
Anche se lo schermo soppressore può essere un metodo potente per rivelare potenziali interazioni fisiologiche tra le proteine degli effetti batterici e le vie dell’ospite, la proteina degli effetti batterici deve indurre un difetto di crescita nel lievito, altrimenti schermo soppressore sarà di scarsa utilità. Inoltre, il fenotipo tossico deve comportare una crescita di almeno 2-3 log10 o sarà difficile identificare i soppressori. Se un laboratorio è impostato per la coltura cellulare, lo screening delle proteine effettori per la tossicità in linee cellulari comuni come HeLa può spesso fornire informazioni sul fatto che valga la pena procedere con lo schermo di tossicità del lievito. L’espressione ectopica della proteina esecutore nelle cellule HeLa a volte si traduce in una tossicità che correla fortemente con la tossicità nel ceppo di lievito utilizzato per questi schermi4. I segni osservabili di stress nelle cellule HeLa includono la perdita di fibre di stress, il distacco cellulare dalla piastra e la condensa nucleare che indica l’apoptosi. Qualsiasi indicazione visiva dello stress nelle cellule HeLa rende la proteina di interesse un buon candidato per indurre un difetto di crescita nel lievito, che si replicano molto più rapidamente e sono quindi più sensibili alla perturbazione delle vie essenziali.
Va notato che lo schermo del soppressore non sempre identifica i partner di associazione dell’ospite come soppressori, ma può ancora implicare componenti critici del percorso o dei percorsi host presi di mira, producendo una visione olistica dei processi biologici dirottati dal proteina degli effetti batterici. In superficie, questo sembra controintuitivo, perché fornire il partner legante della proteina efsiatore in eccesso ci si aspetterebbe per salvare il difetto di crescita. Nel tentativo di identificare i percorsi presi di mira dalla proteina eflacuta c.ocoficida CT229 (CpoS), che si lega ad almeno 10 diversi Rab GTPases durante l’infezione5, nessuno dei partner di legame Rab ha soppresso la tossicità del CT229. Tuttavia, sono stati identificati numerosi soppressori coinvolti nel traffico di vescicle rivestite di clatrari (CCV), il che ha portato a ulteriori lavori di dimostrando che il CT229 sovverte specificamente il traffico di CCV dipendente da Rab. Allo stesso modo, quando si studia la proteina effettore C. burnetii Cbu0041 (CirA) sono stati identificati diversi Rho GTPases che hanno salvato il difetto di crescita del lievito, e in seguito si è scoperto che CirA funziona come una PROTEINa attivando GTPase (GAP) per RhoA4.
L’utilità dello schermo del soppressore del lievito per chiarire le vie dell’ospite mirate alle proteine degli effetti batterici non può essere sopravvalutata, e altri ricercatori che tentano di caratterizzare le proteine degli effetti batterici intracellulari possono trarne grande beneficio queste tecniche. Questi saggi hanno un valore se le immunoprecipitazioni e/o gli schermi ibridi di lievito-due non sono riusciti a trovare un partner vincolante e possono chiarire quali vie sono prese di mira dalla proteina degli effetti batterici. Qui vengono forniti protocolli dettagliati per la tossicità e gli schermi soppressori per identificare i percorsi biologici dell’ospite presi di mira dalle proteine degli effetti batterici intracellulari, nonché alcuni degli ostacoli comuni incontrati quando si utilizzano questi saggi e i loro soluzioni corrispondenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo delinea le procedure passo-passo per identificare i percorsi biologici dell’ospite mirati dalle proteine degli effetti batterici utilizzando una tossicità del lievito modificato e uno schermo soppressore. Il ceppo di lievito utilizzato, S. cerevisiae W303, è auxotrofico sia per uracil che per leucina. L’auxotrotrofia uracildela del ceppo viene utilizzata per selezionare il lievito che trasporta la proteina di interesse sul vettore pYesNTA-Kan, mentre l’auxotrotrotrotrofia leucita viene utiliz…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Shelby Andersen, Abby McCullough e Laurel Woods per la loro assistenza con queste tecniche. Questo studio è stato finanziato dai fondi delle startup del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia dell’Università dell’Iowa a Mary M. Weber.
Materials
| Agar | Fisher Scientific | BP2641500 | |
| Galactose | MilliporeSigma | G0750-1KG | |
| GeneJet Gel extraction kit | ThermoFisher Scientific | K0691 | |
| GeneJet PCR purification kit | ThermoFisher Scientific | K0701 | |
| GeneJet plasmid miniprep kit | Thermo | K0503 | |
| Glucose | MilliporeSigma | G8270-1KG | |
| Herring Sperm DNA | Promega | D1811 | |
| KpnI-HF | New England Biolabs | R3142S | |
| Lithium acetate dihydrate | MilliporeSigma | L6883-250G | |
| Peptone | Fisher Scientific | ||
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Poly(ethylene glycol) 3350 | MilliporeSigma | 1546547-1G | |
| pYep13 | ATCC | 37323 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| Tryptophan | MilliporeSigma | 470031-1G | |
| XhoI-HF | New England Biolabs | R0146S | |
| Yeast extract | Fisher Scientific | BP1422-500 | |
| Yeast miniprep kit | Zymo | D2001 | |
| Yeast nitrogen base without amino acids | MilliporeSigma | Y0626-250G | |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1501-20G | without uracil |
| Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements | MilliporeSigma | Y1771-20G | without uracil, leucine, tryptophan |
Referências
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