基于电润的数字微流体技术利用微升体积液滴表面接触角的电压驱动变化,便于操作。结合功能化磁珠,能够集成多个实验室单元操作,以便使用酶相关的免疫吸附测定 (ELISA) 制备样品和识别病原体。
电润是改变暴露于表面电荷的液滴接触角度的效果。电绝缘电(EWOD)利用薄绝缘体薄膜的介电特性来提高电荷密度,从而提高电润效果。电荷的存在导致电诱导的液滴扩散,从而允许有目的地在疏水表面进行操纵。在这里,我们演示了基于EWOD的协议,通过酶链接免疫吸附测定(ELISA)方法的两种变体,使用自动表面驱动平台,对四类抗原进行样品处理和检测。ELISA 在磁珠上执行,具有固定原抗体,可以选择这些抗体来靶向特定的抗原。与HRP结合的抗体与抗原结合,并与H2O 2/Luminol混合,用于定量捕获的病原体。测定完成时间在6至10分钟之间,同时利用了极少的试剂量。
该方法旨在通过使用基于EWOD的方法对抗原进行定量检测,通过数字微流体(DMF)和磁泳分离,促进ELISA的自动样品制备。已经证明,DMF与磁光合一是液体处理应用1的有趣替代品。更具体地说,病原体的检测是许多领域的一个隐含方面,从医疗保健2到农业和环境3,4到国家安全5。能够应对病原体威胁的检测技术必须具有高通量(例如,短检测时间)、效率(低检测极限 + LoD + 和高灵敏度)和特异性(对目标病原体类型),才能使其正常工作6。
此前,基于EWOD的DMF已成功用于逆转录化聚合酶链反应(RT-PCR),利用低预算印刷电路板芯片和磁质学7检测耐抗生素病原体(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌或MRSA)、肺炎和C.albican。 该技术还应用于通过热测序和化学发光检测8检测脱氧核糖核酸(DNA)突变。基于 EWOD 的平台还将其功能扩展到免疫检测应用,从而在单个集成平台内实现同步样品恢复和检测。例如,通过DMF平台成功演示了单个EWOD芯片设计,用于全血样本中基于珠的免疫检测以及MRSA检测2的单独实验RT-PCR。该芯片利用石油填料,防止液滴蒸发,促进纳米升体积的可靠自动操作。在应用类似的DMF方法(包括定量均质和异质免疫测定9,10包括用于测定参数优化的实验(DoE)研究)中,对多功能生物应用进行了研究。
尽管由于工作量小,工艺集约化具有明显的优点,但充满油的 DMF 平台可能具有挑战性,并且需要一定的专业知识才能运行。充油系统需要密封部件,因此对于某些系统可运输性很重要的现场应用来说并不理想。此外,如果不是不可能,一个石油系统将非常困难,如果不是不可能地利用赵和赵12、Jónsson-Niedziááka等人13和Foat等人提出的表面干燥材料收集等特定应用。相比之下,无油系统易于集成,具有提供易于芯片到芯片的样品转换的优势。出于这些原因,开发该方法是为了在DMF上提供一种基于EWOD的免疫测定,无需油,从而有效地简化了设备操作。
在本文中,我们报告使用定制的、独立、完全自动化的DMF平台进行免疫测定,并详细阐述了快速检测生物分子(即:蛋白质、植物细菌、细菌孢子和病毒)的协议。EWOD芯片与磁性颗粒的结合,用于自动样品制备和免疫沉淀已经证明与额外的线下MS测量15。最近,惠勒小组16日在肯尼亚西北部的偏远人群中对麻疹和风疹IgG进行了现场诊断。惠勒和我们的系统,可运输,自成一体,完全自动化,包括片上,实时化学发光测量可以说是最先进的DMF生物检测系统之一。
这两个系统的设计考虑到了非常不同的应用。惠勒的系统以生物标志物为目标,允许对患者进行生物医学诊断,而我们的生物检测系统则围绕直接检测以前从空气中取样的病原体的防御要求而构建。两者之间的相似性是滴驱动的基本原理,它证明了基于EWOD的技术可以影响的广泛影响生命的部门。即,基于DMF的检测平台和相关EWOD系统可以发现对健康的关键影响(生物医学诊断);军事和民事保护(威胁探测);农业技术(作物监测)和工作安全(受控环境监测)
我们的DMF平台的性能根据人类血清白蛋白(HSA,球状蛋白)、大肠杆菌(大肠杆菌、植物菌)、肌钙杆菌(BG、细菌孢子)和MS2(噬菌病毒)的全自动检测来评估。更重要的是,建议的DMF方法用途非常广泛,因为捕获抗体可以交换,以检测与本文中考虑的四种不同的其他抗原。DMF 平台完全避开了基于抗体的传感,可以构建一种基于 aptamer 生物传感的潜在应用,其中磁珠携带特定的贴切剂,用于捕获和/或检测核苷酸。构成集成、完全独立的DMF平台的不同组件,包括高压波形发生器和驱动电子装置的设计与实现,在其他地方被披露为6。
EWOD 免疫测定方案非常灵活,可以包括各种数量的实验室单元操作(例如,捕获抗原、混合、孵育、珠子提取、洗涤),具体取决于检测协议定义的试剂类型、稳定性和使用要求。作为原则证明,在本篇文章中,两个免疫测定协议被认为显示使用EWOD芯片实现的八或十个LUO(图4)。这种小型化的优点来自微升、离散试剂/解毒剂体积,通过减少试剂的消耗、每次手术所需的时间(基本上为总实验时间(6至10分钟)来提高ELISA的功效。此外,通过定时操作液滴,测定是自动化的,减少了变异,提高了免疫测定17的精度。以目前的格式,该实验涉及在每个测定开始时手动处理液滴,这是下一节中进一步讨论的一点。
当前 DMF 方法的一个关键步骤是将液滴分到 EWOD 芯片表面。通常,带有一次性尖端的微移液器用于测量精确体积并加载它。然而,由于液滴与一次性尖端的带电表面之间的相互作用,在驱动板的疏水表面上固定液滴可能会变得具有挑战性。因此,水滴可以按照尖端的外表面向上射击,而不是停留在板上。为了避免这种情况,微移液器必须保持直立位置,垂直于芯片表面,无需接触,然后通过使其与表面接触,可以将液滴分配到装载板上。如果液滴粘在移液器尖端,将其返回到库存溶液,交换尖端并重新存放新的液滴。在进一步发展目前的概念验证系统时,可以设想自动交付电滴。
在运行测定之前,另一个关键步骤是关闭平行板组件的盖子。如协议前面所述,盖子必须滑到驱动板的顶部。盖子的疏水表面可防止位于驱动板上的液滴变形和位移。为了保证液滴的平稳移动,强烈建议使用原始驱动板、正确装载液滴和芯片组件。驱动板的可重用性是可能的;然而,循环次数取决于驱动电压(图3)和分析剂/试剂沉积到表面,又名生物污染。该平台采用镀铬印花EWOD芯片,可在120 V的工作电压下连续测量多达4次,每次实验后进行中间板清洗, 可可靠地重复使用。板材被回收,以降低每次实验的成本,通过去污(在彻底洗污之前用未稀释的清洁剂刷表面),生物污染的非晶状氟聚合物(材料表)涂层和旋转涂层在板的顶部新鲜。然而,驱动板回收需要手动处理、昂贵的试剂(非晶态氟聚合物(材料表))和专用设备(纺布涂层)。替代EWOD芯片成功地研究与具有成本效益的基板,如纸19,醋酸薄膜或印刷电路板(PCB)20,21。这种一次性耗材可以促进 DMF 平台的可靠和负担得起的使用,并提供避开生物污染问题的方法。
生物污染是EWOD在生物应用中的主要限制22,23。早期对DMF的研究已经确定了两种促进生物污染的机制,即疏水相互作用引起的被动吸附,以及施加电场时电驱动吸附的电化吸收。本文中的发现与这一理论一致,因为据记载,驱动板在高驱动电压下可重用性降低。一个可能的解释是,蛋白质在氟聚合物涂层(类似铁氟龙)表面容易吸附,与原始表面相比,在结垢时聚合得更快24。因此,DMF上与蛋白质相关的检测很难量化,并可能遭受分析剂损失、交叉污染和精度降低17。最坏的情况是,当一个临界量的蛋白质吸附,从而使设备无用的。为了尽量减少生物污染,已经研究了各种方法,从最小化芯片上液滴的停留时间,通过涂层23,到添加剂(即表面活性剂或普鲁辛酸)到生物材料载重液滴6,22。因此,EWOD免疫测定的一个重要方面是选择与现有特定方案兼容的抗生物污染策略。
自动化 DMF 平台设计为每次运行执行单个三明治 ELISA 测试,同时对试剂和分析试剂使用微升体积。必要时,传统的三明治ELISA套件基于预涂96孔或384孔板,与辅助实验室设备相结合,可提高每次运行的吞吐量;仅根据试剂价格,每个测定/井的大致成本分别为6.04美元(580美元/96美元)和0.33美元(2~580美元/384美元)。这使得传统的ELISA方法非常适合在集中实验室设施中经过培训的技术人员处理的大量样品。然而,在偏远地区,环境监测ELISA的详细成本分析表明,当资本成本(即实验室运营成本、经常性费用、样品运输、用品和人员)包括在内时,每个ELISA的实际价格为60美元,其中34美元用于每个样品25的用品。相比之下,建议的DMF平台是便携式的,需要最少的操作训练,预涂覆珠可以在几分钟内提供样品到答案的分析。因此,所提出的技术可以部署到需要点的位置,并补充中央实验室中现有的分析。
在代表性结果部分,自动化DMF免疫测定平台用于直接检测病原体,用于防御应用。DMF 平台的其他可能应用包括但不限于生物诊断、连续监控和自动采样。DMF 可能会影响不同部门,从个性化医疗保健的护理点,以及保护患者免受空气传播感染的受控环境监测,到农业和作物监测系统粮食生产。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢微流体与微工程研究组的同事在机械设计和系统集成方面的贡献。作者要感谢 Dstl Porton Down 对过去和正在进行的项目的宝贵支持和资金贡献,这些项目进一步开发了 DMF 技术及其应用。
(4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, HEPES | Sigma-Aldrich | H9897 | |
Anti-Human Serum Albumin [15C7] | Abcam | ab10241 | |
Anti-Human Serum Albumin [1A9] (HRP) | Abcam | ab24438 | |
B. atrophaeus (BG) spores | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Biotinylated Rb anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Blocker Casein | Thermo Scientific | TFS 37582 | |
CNC Dicing/Cutting Saw | MTI Corp, USA | SYJ-400 | |
Cytop | AGC, Japan | CTL-809M | Amorphous fluoropolymers. This is a two component coating. |
E. coli MRE 162 | Dstl, UK | N/a | |
Goat anti-MS2 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Hamamatsu photodiode | Hamamatsu, Japan | S9270 | |
Hidrochloric acid (32%) | Sigma-Aldrich | W530574 | |
Mask manufacturing service | Compugraphics, Scotland, UK | N/a | |
MS2 virus | Dstl, UK | N/a | |
Parylene-C, DPX-C | Specialty Coating System, USA | CAS No.: 28804-46-8 | |
Pierce Direct Magnetic IP/Co-IP Kit | Thermo Scientific | 88828 | Contains all buffers and reagents required for enzyme immobilisation. Store at 4 °C. |
Rb anti-BG polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Rb anti-E. coli MRE 162 polyclonal | Dstl, UK | N/a | |
Recombinant Human Serum Albumin protein, HAS | Abcam | ab201876 | |
SCS Parylene Deposition System | Specialty Coating System, USA | 2010 | |
Silicon wafer, 4'', p-type, <100>, 1–10 Ωcm | Pi Kem Ltd | N/a | |
Spin Coater | SÜSS MicroTec AG, Germany | ||
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo Scientific | 37075 | It contains 50 mL of Luminol/ Enhancer and Stable Peroxide solutions. Store at 4 °C. |
Tween 80 | Thermo Scientific | 28328 | The manifacturer is Surfact-Amps Detergent Solution. |