Entwicklung eines nichtinvasiven, laserunterstützten Versuchsmodells des cornealen Endotheliaalzellverlustes
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Ablösung von hornhauten Endothelzellen (CEC) von Descemets Membran (DM) unter Verwendung eines Neodym:YAG (Nd:YAG) Lasers als Ex-vivo-Krankheitsmodell für bullöse Keratopathie (BK) vor.
Abstract
Nd:YAG-Laser werden seit mehreren Jahrzehnten zur Durchführung nichtinvasiver intraokularer Operationen wie Capsulotomie eingesetzt. Der prägnante Effekt beruht auf dem optischen Abbau am Laserfokus. Akustische Schockwellen und Kavitationsblasen werden erzeugt, was zu Gewebebrüchen führt. Blasengrößen und Druckamplituden variieren je nach Pulsenergie und Position des Brennpunkts. In dieser Studie wurden enukleierte Schweineaugen vor einem handelsüblichen Nd:YAG-Laser positioniert. Getestet wurden variable Pulsenergien sowie verschiedene Positionen der Brennpunkte hinter der Hornhaut. Die resultierenden Läsionen wurden durch Zwei-Photonen-Mikroskopie und Histologie bewertet, um die besten Parameter für eine exklusive Ablösung von Hornhaut-Endothelzellen (CEC) mit minimalen Kollateralschäden zu bestimmen. Die Vorteile dieser Methode sind die präzise Ablation der KEK, reduzierte Kollateralschäden und vor allem die berührungslose Behandlung.
Introduction
Transparenz der Hornhaut ist wichtig für die Übertragung von Licht auf die Netzhaut und ihre Photorezeptoren1. In dieser Hinsicht ist ein relativer Zustand der Dehydrierung entscheidend, um die Kollagenfasern innerhalb der Hornhautstroma richtig ausgerichtet zu halten. Diese Homöostase wird von hornhauten Endothelzellen (CEC) auf der Descemet-Membran (DM)2aufrechterhalten. Das Endothel ist die innerste Hornhautschicht. Es hat eine wichtige Barriere- und Pumpenfunktion, die für die Hornhauttransparenz3von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz zum Epithel ist das Endothel nicht in der Lage,sich 4zu erneuern. Daher stimuliert jede Durcherkrankung oder ein Trauma verursachte Zellschädigung die verbleibenden Endothelzellen, sich zu vergrößern und zu wandern, die resultierenden Defekte zu decken und die Hornhautfunktionalität aufrechtzuerhalten5. Wenn die CEC-Dichte jedoch unter einen kritischen Schwellenwert fällt, führt die Dekompensation des Endothels zu einem Ödem, was zu verschwommenem Sehen und Beschwerden oder sogar starkenSchmerzen4 führt. Trotz der Verfügbarkeit von Medikamenten zur Linderung von Symptomen ist derzeit die einzige definitive Behandlung in diesen Fällen die Hornhauttransplantation, die in Form eines Volldickentransplantats oder einer lamellaren Endotheltransplantation durchgeführt werden kann. Letzteres Verfahren ist als Descemet-Membran-Endothel-Keratoplastik (DMEK) sowie als Descemet-Abisolier-Automatik-Keratoplastik (DSAEK)6erhältlich. Der Schutz der verbleibenden KEK und die Verbesserung ihres Überlebens könnten jedoch ein alternatives Ziel sein, das ein angemessenes Krankheitsmodell benötigt, um potenzielle therapeutische Medikamente zu testen.
Aktuelle CEC-Verlustkrankheitsmodelle konzentrieren sich auf die Zerstörung des Endothels durch Injektion von toxischen Wirkstoffen (z.B. Benzalkoniumchlorid) in die Vorderkammer oder durch mechanischea Briesion der Zellen mit einer invasiven Descemetorhexis-Technik7,8. Während diese Modelle gut etabliert sind, gibt es Nachteile wie allgemeine Entzündungsreaktionen und ungenaue Kollateralschäden. Daher stellen diese Modelle eher die Endstadien der Krankheit dar, wenn die oben genannten chirurgischen Optionen unvermeidlich sind.
Mit Fortschritten in zellulären Behandlungsstrategien wie Stammzellen und Gentherapie könnte die Anwendung dieser zellulären Therapien in frühen Stadien des CEC-Verlusts9nützlich sein. Anschließend brauchen wir ein Modell, das diese früheren Stadien der Krankheit angemessener darstellt. In dieser Hinsicht haben sich die Zellkulturmodelle in den letzten zehn Jahren verbessert, sind aber in ihrer Gültigkeit immer noch begrenzt, da Zellen in vitro nicht annähernd an die Replikation der komplexen Wechselwirkungen herankommen können, die zwischen den verschiedenen Zelltypen innerhalb der Hornhaut10auftreten. Daher sind Ex-vivo- und In-vivo-Krankheitsmodelle nach wie vor sehr gefragt, und die Verbesserung der bestehenden sind von größtem Interesse.
Nichtinvasive, intraokulare Chirurgie durch Photodisruption mit einem Neodym:YAG (Nd:YAG) Laser ist seit seiner Einführung ende der 1970er Jahre weltweit zu einem Routineverfahren für Augenärzte weltweit geworden11. Photodisruption beruht auf nichtlinearer Lichtabsorption, die zur Bildung von Plasma, der Erzeugung akustischer Stoßwellen und der Bildung von Kavitationsblasen führt, wenn sich der Einsatzort in einer flüssigen Umgebung befindet12. Im Allgemeinen tragen diese Prozesse zur beabsichtigten Wirkung eines präzisen Gewebeschneidens bei. Sie können jedoch auch die Quelle unnötiger Kollateralschäden sein, die die lokale Einschließung der Laserchirurgie begrenzen13.
Die Vorhersage der resultierenden mechanischen Effekte hat sich durch die Charakterisierung der Stoßwellenausbreitung und des Kavitationsverlaufs deutlich verbessert. Unser Ziel ist es, die KEK mit möglichst geringen Schäden an umgebendem Gewebe ins Visier zu nehmen, um ein nichtinvasives, lasergestütztes experimentelles Krankheitsmodell für die frühen Stadien des CEC-Verlusts bereitzustellen. Dazu ist es notwendig, die optimalen Pulsenergien und Positionen der Brennpunkte des Lasers zu bestimmen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Ergebnisse dieser Pilotstudie deuten darauf hin, dass ein Nd:YAG-Laser verwendet werden kann, um hornhaut-Endothelzellen selektiv abzuergänzen, wenn geeignete Parameter für Energiedosis und Fokuspunktposition gewählt werden.
Da die endotheliale Funktion wichtig für die Hornhauttransparenz und den Schutz der Hornhaut vor stromalen Ödemen ist, spielen Modelle der endothelialen Dysfunktion eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Antiödemoderoder-Verfahren. Es gibt mehrere etablierte…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Christine Örün und Jan A. M. Sochurek für ihre Hilfe bei experimentellen Methoden.
Materials
| BARRON VACUUM TREPHINE | Katena | K20-2058 | |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose | PAA | E-15009 | |
| Eye holder | Self | N/A | |
| Inverted Microscope | Leica | DMI 6000 B | |
| KH2PO4 | Merck | 529568 | |
| Na2HPO4 | Merck | 1065860500 | |
| Nd:YAG laser | Zeiss Meditec | visuLAS YAG II plus | |
| OCT Tissue Tek | Sakura Finetechnical | 4583 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010056 | |
| Porcine serum | Sigma-Aldrich | 12736C | |
| Spectral-domain optical coherence tomograph | Heidelberg Engineering | Spectralis | |
| Tissue culture plate 12-well | Sarstedt | 833921 | |
| Two-Photon Microscope | JenLab | DermaInspect | |
| Viscoelastic | OmniVision | Methocel |
Referências
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