使用嘧啶类似物5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）和细胞周期标志物在质谱细胞术平台中建立细胞周期期
Summary
该协议调整细胞周期测量以用于质质细胞术平台。凭借质谱细胞术的多参数功能，直接测量碘掺入可以鉴定S期细胞，而细胞内循环标记物可以在一系列实验条件下表征每个细胞周期状态。
Abstract
细胞周期阶段的调节是细胞增殖和稳态的一个重要方面。控制细胞周期的调节机制的破坏是许多疾病的特征，包括癌症。对细胞周期的研究需要能够定义细胞周期进程的每个部分中的细胞数量，以及清楚地描绘每个细胞周期阶段之间的细胞数量。质谱细胞术（MCM）的出现为通过直接测量元素同位素进行高通量单细胞分析提供了巨大的潜力，并且通过MCM测量细胞周期状态的方法的开发进一步扩展了MCM的实用性。在这里，我们描述了一种在MCM系统中直接测量5-碘-2′-脱氧尿苷（IdU）的方法，类似于5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）。使用这种基于 IdU 的 MCM 具有多种优势。首先，IdU在合成过程中迅速掺入DNA中，允许在短至10-15分钟的孵育中可靠地测量S期细胞。其次，IdU的测量不需要二抗或DNA降解。第三，IdU染色可以很容易地与细胞周期蛋白B1，磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（pRb）和磷酸化组蛋白H3（pHH3）的测量相结合，它们共同提供了五个细胞周期阶段的清晰描述。将这些细胞周期标记物与MCM可能具有的大量参数相结合，可以与许多其他指标相结合。
Introduction
质谱分析利用质谱的高分辨率和定量特性，可以检测大约40个参数。使用金属标记抗体代替荧光团偶联抗体，后者允许更多通道并产生最小的溢出1，2。与流式细胞术相比，MCM在细胞周期分析方面各有优缺点。MCM的一个主要优点是，大量的参数能够同时测量高度异质样品中大量免疫表型不同的T细胞类型的细胞周期状态。MCM已成功用于测量人骨髓3和端粒酶缺陷4的转基因鼠模型正常造血期间的细胞周期状态。对急性髓系白血病（AML）细胞周期状态的分析表明，细胞周期与对临床治疗的已知反应相关，提供了对功能特征的体内洞察，可以为治疗选择提供信息5。质谱细胞术细胞周期分析的第二个优点是能够测量可能与细胞周期状态相关的大量其他功能标志物。最近的工作已经能够通过使用IdU和针对BRU和rRNA6的金属标记抗体将蛋白质和RNA合成与细胞周期状态相关联。这种高度参数化的分析在连续分化过程中测量众多群体的细胞周期状态，使用目前的流式细胞术技术几乎是不可能的。MCM的主要缺点是缺乏与荧光流式细胞术中使用的DNA或RNA染色剂相当的DNA或RNA染色剂（例如DAPI，Hoechst，Pyronin Y等）。荧光染料可以相对精确地测量DNA和RNA含量，但这种精度只有在核苷酸碱基之间插层时这些染料的荧光特性发生变化时才有可能。因此，MCM分析无法以类似的精度测量DNA或RNA含量。相反，质谱细胞术细胞周期分析依赖于与细胞周期状态相关的蛋白质的测量，例如细胞周期蛋白 B1、磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白 （pRb） 和磷酸化组蛋白 H3 （pHH3），并结合直接测量碘原子从 IdU 掺入 S 期细胞。这两种测量方法在正常细胞增殖期间产生高度相似的结果，但当细胞周期进程被破坏时可能会不一致。
测量每个细胞周期阶段的细胞数量对于了解正常的细胞周期发育以及细胞周期破坏非常重要，这在癌症和免疫疾病中很常见。MCM 使用金属标记抗体提供细胞外和细胞内因子的可靠测量;然而，S相的测量受到限制，因为基于铱的DNA插入器无法区分2N和4N DNA。为了定义细胞周期阶段，Behbehani开发了一种利用质量为127的IdU的方法，该方法落在质谱细胞仪的范围内，并允许直接测量S期3中的细胞。这种直接测量避免了对二抗或使用DNA变性剂（如酸或脱氧核糖核酸酶）的需求。结合细胞内循环标志物，它可以在实验模型中实现细胞周期分布的高分辨率。
该协议适用于MCM常见流式细胞术方案的细胞周期测量。我们的方法提供了一种方便和简单的方法来包含细胞周期参数。体外样品的IdU掺入仅需在37°C下孵育10至15分钟，这比大多数BrdU染色方案短，建议孵育时间为数小时3，7。IdU和BrdU掺入的样品可以使用蛋白质组学稳定剂固定，然后在-80°C冰箱中储存一段时间。这允许将大量 IdU 染色样品存档以进行批量分析，而不会降低样品质量。
Protocol
Representative Results
Discussion
此处提供的示例演示了如何使用MCM平台分析细胞周期分布。还证明，细胞周期分析对时间和温度等实验条件很敏感，这是研究人员在考虑MCM进行细胞周期分析时必须考虑的重要考虑因素14。样品在短时间内储存，不超过一小时，其IdU掺入量将与其正常状态相当。样品在封闭系统中长时间（约2小时）将减少IdU掺入，但是，相对循环和非循环级分不会改变，允许粗细胞周期分析。低?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢Palak Sekhri，Hussam Alkhalaileh，Hsiaochi Chang和Justin Lyeberger的实验支持。这项工作得到了Pelotonia奖学金计划的支持。本材料中表达的任何意见、发现和结论都是作者的观点、发现和结论，并不一定反映 Pelotonia 奖学金计划的意见、发现和结论。
Materials
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A3059 | Component of CSM |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | Sample centrifugation |
| Cleaved-PARP (D214) | BD Biosciences | F21-852 | Identification of apoptotic cells |
| Cyclin B1 | BD Biosciences | GNS-1 | G2 Resolution |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | Cryopreservative |
| EQ Four Element Calibration Beads | Fluidigm | 201078 | Internal metal standard for CyTOF performance |
| FACS Tube w/ mesh strainer | Corning | 08-771-23 | Cell strainer to remove clumps/debris before CyTOF run |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 97068-085 | Cell culture growth supplement |
| Helios | Fluidigm | CyTOF System/Platform | |
| Heparin | Sigma | H3393 | Staining additive to prevent non-specific staining |
| IdU (5-Iodo-2′-deoxyuridine) | Sigma | I7125 | Incorporates in S-phase |
| Ki-67 | eBiosciences | SolA15 | Confirmation of G0/G1 |
| MaxPar Multi Label Kit | Fluidigm | 201300 | Metal labeling kit, attaches metals to antibodies |
| Microplate Shaker | Thermo Scientific | 88880023 | Mixing samples during staining |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Services | 15710 | Fixative |
| pentamethylcyclopentadienyl-Ir(III)-dipyridophenazine | Fluidigm | 201192 | Cell identification during CyTOF acquisition |
| p-H2AX (S139) | Millipore | JBW301 | Detection of DNA damage |
| p-HH3 (S28) | Biolegend | HTA28 | M-phase Resolution |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Wash solution for cell culture and component of fixative solution |
| p-Rb (S807/811) | BD Biosciences | J112906 | G0/G1 Resolution |
| Proteomic Stabilizer | SmartTube Inc | PROT1 | Sample fixative |
| RPMI 1640 | Gibco | 21870-076 | Cell culture growth medium |
| Sodium Azide | Acros Organics | AC447810250 | Component of CSM/Antibody buffer, biocide |
Referências
- Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. Multiple cellular antigen detection by ICP-MS. Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).
- Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Analytical Chemistry. 80 (7), 2539-2547 (2008).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81 (7), 552-566 (2012).
- Raval, A., et al. Reversibility of Defective Hematopoiesis Caused by Telomere Shortening in Telomerase Knockout Mice. PLoS One. 10 (7), 0131722 (2015).
- Behbehani, G. K., et al. Mass Cytometric Functional Profiling of Acute Myeloid Leukemia Defines Cell-Cycle and Immunophenotypic Properties That Correlate with Known Responses to Therapy. Cancer Discovery. 5 (9), 988-1003 (2015).
- Kimmey, S. C., Borges, L., Baskar, R., Bendall, S. C. Parallel analysis of tri-molecular biosynthesis with cell identity and function in single cells. Nature Communications. 10 (1), 1185 (2019).
- Rabinovitch, P. S., Kubbies, M., Chen, Y. C., Schindler, D., Hoehn, H. BrdU-Hoechst flow cytometry: a unique tool for quantitative cell cycle analysis. Experimental Cell Research. 174 (2), 309-318 (1988).
- Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cytometry A. 89 (6), 601-607 (2016).
- McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis. Journal of Visualized Experiments. (122), e54394 (2017).
- Behbehani, G. K. Immunophenotyping by Mass Cytometry. Methods in Molecular Biology. 2032, 31-51 (2019).
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. Journal of Visualized Experiments. (69), e4398 (2012).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83 (5), 483-494 (2013).
- Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Current Protocols in Cytometry. , 17 (2010).
- Devine, R. D., Sekhri, P., Behbehani, G. K. Effect of storage time and temperature on cell cycle analysis by mass cytometry. Cytometry A. 93 (11), 1141-1149 (2018).
- Campos, L., et al. Expression of immunological markers on leukemic cells before and after cryopreservation and thawing. Cryobiology. 25 (1), 18-22 (1988).
- Kadic, E., Moniz, R. J., Huo, Y., Chi, A., Kariv, I. Effect of cryopreservation on delineation of immune cell subpopulations in tumor specimens as determinated by multiparametric single cell mass cytometry analysis. BMC Immunology. 18 (1), 6 (2017).
- Shabihkhani, M., et al. The procurement, storage, and quality assurance of frozen blood and tissue biospecimens in pathology, biorepository, and biobank settings. Clinical Biochemistry. 47 (4-5), 258-266 (2014).
