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Biology

समुद्र ककड़ी आंतों की कोशिकाओं की एक प्राथमिक संस्कृति में एपोप्टोसिस प्रेरण और पता लगाने

Published: January 21, 2020 doi: 10.3791/60557
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, Marine Science College, Zhejiang Ocean University

Summary

यह प्रोटोकॉल समुद्री ककड़ी प्रेरित जापोन्कुस से आंतों की कोशिकाओं को संस्कृति के लिए एक आसान-से-हैंडल विधि प्रदान करता है और Echinodermata, मोलस्का और क्रस्टेसिया सहित समुद्री जीवों से विभिन्न व्यापक रूप से उपलब्ध ऊतक नमूनों के साथ संगत है।

Abstract

जैविक पदार्थों के कार्यात्मक मूल्यांकन या विशिष्ट जैविक गतिविधियों के लक्षण वर्णन के लिए असाधारण रूप से महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में विभिन्न वैज्ञानिक विषयों में प्राथमिक सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है। हालांकि, सार्वभौमिक रूप से लागू सेल संस्कृति मीडिया और प्रोटोकॉल की कमी के कारण, समुद्री जीवों के लिए अच्छी तरह से वर्णित सेल संस्कृति विधियां अभी भी सीमित हैं। इस बीच, आमतौर पर होने वाली माइक्रोबियल संदूषण और समुद्री अकशेरुकी कोशिकाओं के पॉलीट्रोपिक गुण समुद्री अकशेरुकी के लिए एक प्रभावी सेल संस्कृति रणनीति की स्थापना में बाधा डालते हैं। यहां, हम समुद्री ककड़ी एपोस्टिचोपस जैपोनिकससे आंतों की कोशिकाओं को संजोने के लिए एक आसान-से-हैंडल विधि का वर्णन करते हैं; इसके अतिरिक्त, हम प्राथमिक सुसंस्कृत आंतों की कोशिकाओं में इन विट्रो एपोप्टोसिस इंडक्शन और डिटेक्शन का एक उदाहरण प्रदान करते हैं। इसके अलावा, यह प्रयोग उपयुक्त संस्कृति माध्यम और सेल संग्रह विधि के बारे में विवरण प्रदान करता है। वर्णित प्रोटोकॉल Echinodermata, Mollusca, और क्रस्टेसा सहित समुद्री जीवों से व्यापक रूप से उपलब्ध ऊतक नमूनों की एक किस्म के साथ संगत है, और यह कई इन विट्रो प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान कर सकते हैं । यह तकनीक शोधकर्ताओं को समुद्री अकशेरुकी से प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों में कुशलतापूर्वक हेरफेर करने और कोशिकाओं पर लक्षित जैविक सामग्रियों के कार्यात्मक मूल्यांकन को सुगम बनाने में सक्षम बनाएगी ।

Introduction

कृत्रिम रूप से नियंत्रित परिस्थितियों के तहत कोशिकाओं को संजोना, और उनके प्राकृतिक वातावरण में नहीं, जैविक अध्ययन के लिए एक समान प्रयोगात्मक सामग्री प्रदान करता है, विशेष रूप से प्रजातियों के लिए जिन्हें प्रयोगशाला के वातावरण में आसानी से सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है। समुद्री अकशेरुकी सभी पशु प्रजातियों के 30% से अधिक के लिए खातेहैं,और वे पुनर्जनन2,3,तनाव प्रतिक्रिया4,और पर्यावरण अनुकूलन5,6के रूप में विशिष्ट जैविक प्रक्रियाओं के नियामक तंत्र पर अनुसंधान शुरू करने के लिए कई जैविक सामग्री प्रदान करते हैं ।

समुद्री ककड़ी, पोस्टिचोपस जैपोन्कुस,उत्तरी प्रशांत तट के साथ शीतोष्ण जल में रहने वाली सबसे अधिक अध्ययन की जाने वाली echinoderm प्रजातियों में से एक है। यह एक व्यावसायिक रूप से महत्वपूर्ण प्रजातियों के रूप में जाना जाता है और पूर्वी एशिया में बड़े पैमाने पर, विशेष रूप सेचीन7 में मारीकल्चर किया जाता है। ए जैपोनिक सहित ए जैपोनिकसके बारे में कई वैज्ञानिक प्रश्न, जिनमें एस्टिजन8 के बाद आंतों के उत्थान में अंतर्निहित नियामक तंत्र और एस्टिवेशन9में पतन, मेटाबोलिक नियंत्रण10,11,और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया12,13 थर्मल या रोगजनक तनावके तहत, शोधकर्ताओं का ध्यान आकर्षित किया है। हालांकि, अच्छी तरह से अध्ययन मॉडल जानवरों के साथ तुलना में, बुनियादी अनुसंधान, विशेष रूप से सेलुलर स्तर पर, तकनीकी बाधाओं से सीमित है, जैसे उन्नत सेल संस्कृति विधियों की कमी के रूप में ।

शोधकर्ताओं ने सेल लाइनों की स्थापना के लिए बहुत प्रयास समर्पित किया है, लेकिन वे भी कई चुनौतियों का सामना करना पड़ा है और किसी भी समुद्री अकशेरुकी से कोई सेल लाइन अभी तक14स्थापित किया गया है । हालांकि, समुद्री अकशेरुकी से प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों पिछले दशकों में उन्नतहै 15,16,और वे सेलुलर स्तर पर प्रयोग के लिए एक अवसर प्रदान की है । उदाहरण के लिए, ए जैपोन्यूस से पुनर्जीवित होने वाले इंटेसिन का उपयोग दीर्घकालिक कोशिका संस्कृतियों के लिए कोशिकाओं के स्रोत के रूप में किया गया है जिसने समुद्री अकशेरुकी17की प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए एक व्यावहारिक विधि प्रदान की। यह प्रोटोकॉल संयुक्त और अनुकूलित अकशेरुकी कोशिका संस्कृति दृष्टिकोण और समुद्री ककड़ी या अन्य समुद्री अकशेरुकी के लिए एक व्यापक रूप से उपयुक्त प्राथमिक संस्कृति विधि विकसित की है।

एपोप्टोसिस विभिन्न एक्सोजेनस और एंडोजेनस उत्तेजनाओं द्वारा शुरू किया गया एक आंतरिक सेल आत्महत्या कार्यक्रम है। समन्वित एपोप्टोसिस18,19कई जैविक प्रणालियों के लिए महत्वपूर्ण है और इसे एस्टिवेशन9के दौरान समुद्री ककड़ी के आंतों के प्रतिगमन में फंसाया गया है । ब्याज के जीवों में अपोप्टिक प्रक्रिया की जांच करने के लिए, Hoechst धुंधला और माइक्रोस्कोपी परख सहित तरीकों की एक श्रृंखला, स्थापित किया गया है और सफलतापूर्वक20लागू किया । यहां, हमने समुद्री अकशेरुकी के जैविक अध्ययन में प्राथमिक कोशिकाओं की उपयोगिता का आकलन करने के लिए समुद्री ककड़ी की प्राथमिक सुसंस्कृत आंतों की कोशिकाओं में एपोप्टोसिस इंडक्शन और डिटेक्शन का आयोजन किया। आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले सिंथेटिक ग्लूकोकोटिकोस्टेरॉयड21में से एक, डेक्क्सेथेसोन का उपयोग समुद्री ककड़ी से सुसंस्कृत आंतों की कोशिकाओं में एपोप्टोसिस को प्रेरित करने के लिए किया जाता था, और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा दागित कोशिकाओं में महत्वपूर्ण होईसीएसटी 33258 सिग्नल का सफलतापूर्वक पता लगाया गया था।

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Protocol

1. सेल कल्चर मीडियम तैयारी

  1. लौकिक द्रव तैयारी
    1. लौकिक द्रव संग्रह: बाँझ स्थितियों के तहत, एक स्वस्थ समुद्री ककड़ी (85-105 ग्राम का गीला वजन) को विच्छेदन करें, लौकिक तरल पदार्थ एकत्र करें, और इसे बाँझ ग्लास फ्लास्क में स्टोर करें।
    2. कोलोमिक सेल हटाने: 5 0 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूबों में 5 0 एमएल सेंट्रलाइज ट्यूबों में 5 मिन के लिए 1,700 x ग्राम में सेंट्रलाइज्ड और सुपरनेटेंट को एक नए बाँझ ग्लास फ्लास्क में स्थानांतरित करें; इसके बाद, समुद्री ककड़ी के सेल-मुक्त लौकिक तरल पदार्थ एकत्र करें।
    3. पूरक घटक निष्क्रियता: पूरक घटकों-निष्क्रिय लौकोपद्र द्रव प्राप्त करने के लिए 20-40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में समुद्री ककड़ी लौकिक तरल पदार्थ युक्त बाँझ ग्लास फ्लास्क को इनक्यूबेट करें।
    4. माइक्रोब हटाने: 0.22 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से छानने से बैक्टीरिया और क्लैमाइडिया निकालें। इसके बाद, कॉस्लोमिक फ्लूइड प्रीट्रीटमेंट समाधान प्राप्त करने के लिए 0.1 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर का उपयोग करके निस्पंदन द्वारा माइकोप्लाज्मा और अन्य ठीक कणों को हटा दें।
    5. लवणता समायोजन: 20% उच्च एकाग्रता प्रीस्टरीइज्ड और फ़िल्टर किए गए नैल समाधान (प्रीट्रीट्ड कॉलोमिक तरल पदार्थ द्वारा पतला) या डीडीडब्ल्यू (डबल आसुत पानी) जोड़कर ब्रह्मांडीय द्रव पूर्वउपचार समाधान की लवणता को 30% (सालिनोमीटर द्वारा मापा जाता है) को समायोजित करें। समुद्री ककड़ी लौकिक तरल पदार्थ को बाँझ बोतल में स्थानांतरित करें, बोतल को सील करें, और तरल पदार्थ को आगे के प्रयोगों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. लीबोविट्ज की एल-15 सेल संस्कृति मध्यम अनुकूलन
    1. एनसीएल का 5.05 ग्राम वजन, केसीएल का 0.135 ग्राम, सीएसीएल2का 0.15 ग्राम, एनए2का 0.25 ग्राम एसओ4,एमजीसीएल2का 0.975 ग्राम, 0.25 ग्राम ग्लूकोज, और 6.25 मिलीग्राम टॉरिन और उन्हें 50 मीटर लीटर के एल-15 मीडियम के 40 मिलीलीटर में पतला करें। 1 घंटे के लिए एक शेखर पर ट्यूब उत्तेजित करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए लवण पूरी तरह से भंग कर दिया है ।
    2. एल-ग्लूटामाइन (100 मिलीग्राम/mL) के 2.5 mL और पहले से तैयार लीबोविट्ज के एल-15 मीडियम में 500 माइक्रोन ऑफ वीई सॉल्यूशन (1.75 मिलीग्राम/एल) जोड़ें और 0.22 माइक्रोन झिल्ली फिल्टर के माध्यम से माध्यम को और फ़िल्टर करें।
    3. ताजा लीबोविट्ज के एल-15 माध्यम के साथ कुल मध्यम मात्रा को 500 एमएल में समायोजित करें और पहले से तैयार लौकिक तरल पदार्थ के 100 एमएल के साथ; इसके बाद, नाओएच समाधान का उपयोग करके पीएच को 7.6 पर समायोजित करें। ऑपरेशन प्रक्रिया को बाँझ वातावरण में रखें। कॉस्लोमिक द्रव का यौगिक अनुपात 10%-50% हो सकता है, और 20% ए जैपोन्कुस आंतों की कोशिकाओं संस्कृति के लिए पर्याप्त है।

2. आंतों की सेल तैयारी

  1. समुद्री ककड़ी आंत प्रसंस्करण
    1. एक बर्फ बॉक्स में स्वस्थ समुद्री खीरे का एनेस्थेटाइज़ करें। पूर्वकाल आंतों को विच्छेदन और एकत्र करें, फिर ऊतक के नमूनों को खड़ी रूप से अनुभागित करें और आंतरिक सामग्री को हटा दें।
    2. फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) में ऊतक के नमूनों को दो बार धोएं और उन्हें एक जलीय इथेनॉल समाधान (मात्रा से 75%) में विसर्जन करके कीटाणुरहित करें 2 एस से अधिक समय तक।
    3. इथेनॉल को हटाने और 2.0 मिलीग्राम बाँझ माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब में लगभग 100 मिलीग्राम ऊतक नमूने स्थानांतरित करने के लिए पीबीएस में ऊतक के नमूनों को तीन बार धोएं।
  2. सेल संग्रह
    1. समुद्र ककड़ी आंतों के ऊतकों ब्लॉक में पूर्व-अनुकूलित संस्कृति माध्यम का 1.5 मिलील जोड़ें और समाधान के बादल होने तक निष्फल सर्जिकल कैंची के साथ ब्लॉक को कीमा दें।
      नोट: वैकल्पिक सरलीकृत प्रोटोकॉल के लिए, समुद्र ककड़ी आंतों के ऊतकों ब्लॉक में पूर्व-अनुकूलित संस्कृति माध्यम का 0.5 मिलील जोड़ें और ब्लॉक को 1 मिमी3में निष्फल सर्जिकल कैंची के साथ काट दें। बाद में इनक्यूबेटिंग चरणों के बाद सीधे नमूनों को संस्कृति व्यंजनों में स्थानांतरित करें।
    2. ट्राइप्सिन (0.25%), उलटा द्वारा समाधान मिलाएं, और कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए इसे इनक्यूबेट करें; फिर, 100 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें।
      नोट: विभिन्न ऊतक नमूनों का इलाज करते समय सेल फैलाव के लिए ट्राइप्सिन जोड़ना वैकल्पिक है। संस्कृति माध्यम में सीए2 + और एमजी2 + से निरोधात्मक गतिविधि को कम करने के लिए ट्राइप्सिन समाधान में एथिलीनडायमिनेटेट्राएटिक एसिड (EDTA) को नियंत्रित किया जाना चाहिए।
    3. एक नया बाँझ 2.0 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब के लिए फिल्ट्रेट ले लीजिए, 3 मिन के लिए 1,700 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, supernatant त्यागने, तो संस्कृति माध्यम में गोली फिर से निलंबित (एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक) और इसे दो बार धोने।
      नोट: प्रयोग की शुरुआत से पहले 2% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (10,000 यू/एमएल पेनिसिलिन और 10 मिलीग्राम/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) और 1% जेंटेमिकिन (4 मिलीग्राम/एमएम) के साथ पूरक ताजा प्री-ऑप्टिमाइज्ड कल्चर मीडियम तैयार करें।

3. सेल संस्कृति

  1. इनक्यूबेटर प्रीसेटिंग: सेल संस्कृति के लिए इनक्यूबेटर को पूर्व निर्धारित करें और इसे 18 डिग्री सेल्सियस और संतृप्त आर्द्रता के तापमान के साथ कम से कम 24 घंटे तक पहले से चलाएं।
    नोट: सेल संस्कृति मध्यम गुणों के आधार पर इनक्यूबेटर में सीओ2 फ़ीड; लीबोविट्ज के एल-15 के बुनियादी माध्यम का उपयोग करते समय किसी सीओ2 की आपूर्ति की आवश्यकता नहीं है।
  2. प्रथम चरण सेल संस्कृति
    1. रोगाणुओं के विकास को बाधित करने और सेल संस्कृति के प्रारंभिक चरण के दौरान प्रसार को बढ़ावा देने के लिए, पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान (10,000 यू/एमएल पेनिसिलिन और 10 मिलीग्राम/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) और 0.5 मिलीग्राम के जेंटेमिकिन (40 मिलीग्राम/एमएल) के 0.5 मिलीग्राम को पूर्व-अनुकूलित संस्कृति के प्रत्येक 500 मिलीएल में जोड़ें। इसके अलावा, इंसुलिन के ०.६ मिलीग्राम (10 मिलीग्राम/mL), इंसुलिन की तरह विकास कारक (०.१ μg/μL) के 100 μL के साथ हर ५०० मिलीग्राम संस्कृति माध्यम पूरक, और फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक के 25 μL (०.१ μg/μL) ।
    2. कोशिकाओं को 1.5 मीटर ट्यूबों में एकत्र करें, उन्हें इंगित मध्यम के 200 माइक्रोन का उपयोग करके फिर से निलंबित करें, और उन्हें 4 सेमी व्यंजनों में पिलेट करें।
    3. एक इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को संस्कृति और 6 घंटे के बाद सेल culturing व्यंजन के लिए संकेत माध्यम के २.० mL जोड़ें । अगले चरण तक पहुंचने तक हर 12 घंटे माध्यम के आधे बदलें ।
      नोट: मध्यम परिवर्तन को धीरे से संभालें, क्योंकि कोशिकाएं व्यंजनों से कसकर जुड़ी नहीं हैं। पॉली-डी-लिसिन-लेपित व्यंजनों का उपयोग पकवान कोशिकाओं से शिथिल संलग्न करने के लिए किया जा सकता है।
  3. दूसरा चरण सेल संस्कृति
    1. सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के प्रतिकूल प्रभावों को कम करने के लिए, संस्कृति माध्यम में संकेत एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन और जेंटेमिसिन) की एकाग्रता को आधे से कम करें।
      नोट: इंसुलिन और विकास कारकों का उपयोग सेल संस्कृति की स्थिति पर निर्भर करता है और वैकल्पिक है।
    2. सेल संस्कृति माध्यम की जगह; कोशिका घनत्व के आधार पर हर दो से तीन दिनों में मध्यम परिवर्तन का संचालन करें।
      नोट: एक माइक्रोस्कोप के तहत दैनिक सुसंस्कृत कोशिकाओं का निरीक्षण करें और विकास की स्थिति रिकॉर्ड करें।
  4. सेल पासिंग
    नोट: पारित होने और कोशिकाओं उपसंस्कृति, जब प्राथमिक सेल घनत्व ६०% तक पहुंचता है ।
    1. कमरे के तापमान पर पीबीएस का उपयोग करके सुसंस्कृत कोशिकाओं को दो बार धोएं। ट्राइप्सिन समाधान (0.25%) के 200 माइक्रोन जोड़ें प्रत्येक पकवान के लिए और मैन्युअल रूप से पूरे नीचे कवर किया जाता है सुनिश्चित करने पकवान उत्तेजित । ट्राइप्सिन समाधान को त्यागें और कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    2. कोशिकाओं को पाइपिंग और फिर से निलंबित करके ताजा संस्कृति माध्यम के 1.0 मिलील के साथ कोशिकाओं को धोएं। सेल निलंबन के 0.5 mL को एक नई डिश में स्थानांतरित करें, ताजा माध्यम का 1.5 मीटर जोड़ें, और कोशिकाओं को 18 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: सेल स्क्रैपर्स सेल संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब ट्राइप्सिन समाधान व्यंजनों से कोशिकाओं को पचाने और अलग करने में विफल रहता है (कुछ सेल लाइनें बहुत चिपकने वाली हैं)। हालांकि दोनों तरीकों का एक साथ संचालन न करें।
    3. 12 घंटे के बाद माध्यम बदलें और शर्तों का मूल्यांकन करने के लिए एक माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। आगे प्रयोगात्मक परख के लिए कोशिकाओं संस्कृति।

4. ए जैपोन्कुस आंतों की कोशिकाओं में एपोप्टोसिस इंडक्शन और डिटेक्शन

  1. सेल कल्चर और डेक्सेथेसोन ट्रीटमेंट
    1. पहले से शुरू किए गए प्रोटोकॉल का पालन करने वाली आंतों की कोशिकाओं को तैयार करें और कोशिकाओं को 2 x 106 प्रति अच्छी तरह की कोशिका मात्रा में 12-अच्छी तरह की प्लेट में ड्रॉपवाइज जोड़ें।
    2. संस्कृति में तीन दिनों के बाद, "पहले चरण सेल संस्कृति" के चरणों के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और मध्यम को अनुकूलित माध्यम (एंटीबायोटिक दवाओं और विकास कारकों के बिना) से प्रतिस्थापित करें।
    3. प्रयोगों की शुरुआत करने से पहले ताजा 2 माइक्रोन और 200 माइक्रोएम डीएक्सएमएस समाधान तैयार करने के लिए संस्कृति माध्यम में पतला डीक्सेथासोन (डीएक्सएमएस)।
    4. विभिन्न सांद्रता में DXMS समाधान जोड़ें सुसंस्कृत कोशिकाओं को एक ही मात्रा में खेती माध्यम के साथ उगाया; नियंत्रण (सीटीएल), 1 माइक्रोन और 100 माइक्रोन डीएक्सएमएस सहित तीन प्रायोगिक समूह निर्धारित करें।
  2. होचस्ट धुंधला
    1. इंगित समय अवधि (0 एच, 24 एच, और ४८ घंटे) के लिए DXMS के साथ/बिना ऊष्मायन के बाद तीन बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं ।
    2. एक 12 अच्छी तरह से थाली के लिए प्रति अच्छी तरह से Hoechst 33258 समाधान के 300 μL जोड़ें और 30 00 के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट. धीरे से प्लेट को उत्तेजित करने के लिए सभी कोशिकाओं को कवर उनके धुंधला सुनिश्चित करने।
    3. Hoechst धुंधला समाधान निकालें और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एक 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान (PBS में) के 300 μL जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें। धीरे से 15 लाख के लिए आंदोलन ।
      सावधानी: पैराफॉर्मलडिहाइड त्वचा के संपर्क या साँस लेने से मामूली विषाक्त है, और इसे संभावित मानव कैंसरजन के रूप में नामित किया गया है। रासायनिक धुएं डाकू, संतुलन बाड़ों, या अन्य सुरक्षात्मक उपायों का उपयोग पैराफॉर्मलडिहाइड के वजन और हैंडलिंग के दौरान किया जाना चाहिए।
    4. तय कोशिकाओं को पीबीएस में तीन बार धोएं। कोशिकाओं को ढकने के लिए धोने के बाद पीबीएस को न छोड़ें।
  3. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी विश्लेषण
    1. पारा लैंप पावर, फ्लोरोसेंट लाइट पावर और पीसी सहित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप हार्डवेयर चालू करें। ऑपरेटिंग सिस्टम खाते में लॉग इन करें, सॉफ्टवेयर लॉन्च करें, और इसके विन्यास की जांच करें।
    2. तैयार प्लेट को माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें। स्टेज कंट्रोलर का उपयोग करके उद्देश्य लेंस पर नमूना स्थिति।
    3. प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत ब्याज की कोशिकाओं का पता लगाएं, फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी पर स्विच करें, और मापदंडों को ट्यूनिंग करके छवियों को कैप्चर करें।
      नोट: हॉक्ली डीएनए के लिए बाध्य Hoechst 33258 फ्लोरोसेंट सिग्नल का निरीक्षण करने के लिए, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी क्रमशः लगभग 352 एनएम और 461 एनएम पर उत्तेजना और उत्सर्जन के साथ आयोजित की जानी चाहिए।

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Representative Results

यहां, हमने ए जैपोन्कुस की प्राथमिक आंतों की कोशिका संस्कृति की स्थापना की और कोशिकाओं को पारित किया। चित्रा 1 पुलिया के विभिन्न चरणों में गोल कोशिकाओं को दिखाता है। और एडु धुंधला परख बाद के चरण में इन दौर कोशिकाओं की प्रसार गतिविधि प्रकट करने के लिए प्रत्यक्ष सबूत प्रदान करते हैं(चित्रा 2)। हमने प्रोटोकॉल को थोड़ा समायोजित किया, निस्पंदक कोशिकाओं के बजाय कीमा बनाया हुआ ऊतक ब्लॉकों को संजोया; इसके अलावा, एक धुरी सेल प्रकार सफलतापूर्वक संस्कारकिया जा सकता है । यह कोशिका प्रकार आंतों के ऊतकब्लॉकों के आसपास हुआ और संस्कृति के चार दिनों के बाद मनाया जा सकता है; हालांकि, यह पारित करने में विफल रहा(चित्रा 3)।

सुसंस्कृत कोशिकाओं का उपयोग विभिन्न जैविक प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। हमने विभिन्न समय अवधियों के लिए डीएक्सएमएस के साथ कोशिकाओं का इलाज किया, इसके बाद एपोप्टिक सेल डिटेक्शन के लिए Hoechst 33258 धुंधला हो गया। चित्रा 4 होचस्ट 33258 धुंधला और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा समुद्री ककड़ी आंतों की कोशिकाओं से पता लगाया प्रेरित अपोप्टोटिक संकेत इंगित करता है। चित्रा 5 DXMS के साथ उत्तेजना के तहत संकेत समय अवधि के लिए अपोप्टोटिक सेल दरों को दर्शाता है ।

Figure 1
चित्रा 1: विभिन्न चरणों में सुसंस्कृत समुद्री ककड़ी आंतों के दौर की कोशिकाओं की माइक्रोस्कोपी। (क)वरीयता प्राप्त होने के बाद तीसरे दिन व्यंजनों के नीचे से जुड़ी कोशिकाएं। (ख)सातवें दिन सेल प्रसार । (ग)पासिंग के बाद व्यंजनों के नीचे से जुड़ी कोशिकाएं। (D)कोशिकाएं जिन्होंने गतिविधि खो दी है और दस मार्गों के बाद मर रही हैं । "मुख्यमंत्री" सेल द्रव्यमान को इंगित करता है, जो सेल प्रसार के दौरान होता है। "बीटी" काले ट्रैक है, जो मृत कोशिकाओं द्वारा छोड़ दिया गया था इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एडू धुंधला परख द्वारा पता लगाया सेल प्रसार । निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार किट(सामग्री की तालिका)का उपयोग करके सेल प्रसार परख ें की गई थीं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सुसंस्कृत समुद्री ककड़ी आंतों के ऊतकों ब्लॉकों और सेल प्रसार की माइक्रोस्कोपी। (A)कल्चर के बाद पहले दिन डिश बॉटम से जुड़े टिश्यू ब्लॉक्स (टीबी) । (ख)संस्कृति के बाद दूसरे दिन डिश बॉटम से जुड़े टिश्यू ब्लॉक और कोशिकाएं । (ग)टिश्यू ब्लॉक और पेरिफेरैली संस्कृति के बाद चौथे दिन धुरी कोशिकाओं (एससी) हुई । (D)संस्कृति के बाद सातवें दिन धुरी कोशिकाओं का प्रसार । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: प्रेरित एपोप्टोसिस के साथ आंतों के गोल कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी। "नेकां" परमाणु संघनन फ्लोरोसेंट संकेत इंगित करता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: Hoechst-सकारात्मक आंतों दौर कोशिकाओं के सांख्यिकीय विश्लेषण । प्रयोग की खुराक या समय पाठ्यक्रम (एन = 3) के साथ Hoechst दाग ए जैपोन्कुस आंतों की कोशिकाओं के बीच परमाणु संघनन फ्लोरोसेंट संकेत-सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत का वितरण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

व्यापक अनुसंधान प्रयास पिछले दशकों में सेल लाइनों की स्थापना के लिए समर्पित किया गया है, हालांकि, समुद्री अकशेरुकी14,22से कोशिकाओं की दीर्घकालिक संस्कृति पर प्रगति करना अभी भी मुश्किल है । यह बताया गया है कि होलोथुरियन ऊतकों को पुनर्जीवित करने से सुसंस्कृत कोशिकाएं लंबे समय तक व्यवहार्य थीं और प्रसार की उच्च गतिविधि का पता विशिष्ट कोशिकाओं17,23में लगाया जा सकता है । हालांकि, सामान्य समुद्री अकशेरुकी कोशिकाओं के लिए, अभी तक कोई व्यावहारिक सेल संस्कृति दृष्टिकोण वर्णित नहीं है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल समुद्री अकशेरुकी प्रजातियों ए जैपोन्कुससे आंतों की कोशिकाओं को खेती और पासिंग करने के लिए एक कुशल और आसानी से व्याख्यात्मक विधि प्रदान करता है। इस विधि को कटलफिश और केकड़ा जैसे कई अलग-अलग समुद्री अकशेरुकी जीवों की प्राथमिक कोशिका संस्कृति के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

प्रमुख कारकों की एक श्रृंखला इस प्रक्रिया के सफल अनुप्रयोग को प्रभावित करती है। पूरी प्रक्रिया के दौरान और विशेष रूप से संस्कृति के पहले सप्ताह के दौरान माइक्रोबियल संदूषण की रोकथाम का सबसे महत्वपूर्ण है। जलीय जानवर आमतौर पर पर्यावरण से कई रोगाणुओं से संपर्क करते हैं, जो गिल, आंत, फिन और त्वचा जैसे अपने ऊतकों को उपनिवेश बनाते हैं। इस प्रकार, कोशिका संस्कृति दीक्षा से पहले ऊतक के नमूनों को निष्फल करना असंभव होगा। कोशिका संस्कृति के दौरान माइक्रोबियल संदूषण के जोखिम को कम करने के लिए, ऊतक नमूना नसबंदी के लिए 75% इथेनॉल विसर्जन आवश्यक है; हालांकि, उपचार के समय को विभिन्न ऊतक प्रकारों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, सेल संस्कृति के प्रारंभिक दौर के दौरान उच्च एंटीबायोटिक सांद्रता का अनुप्रयोग भी माइक्रोबियल विकास के अवरोध में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। इसके अलावा, मध्यम निर्माण सुसंस्कृत कोशिकाओं के प्रसार और जीवन काल का निर्धारण करने वाला एक प्रमुख कारक है। चूंकि समुद्री अकशेरुकी कोशिकाओं की पोषण संबंधी आवश्यकताएं अभी भी अज्ञात हैं, इसलिए उपयोग किए जाने वाले वर्तमान सेल संस्कृति माध्यम को मुख्य रूप से कशेरुकी या कीट कोशिका रेखाओं14के लिए डिजाइन किया गया है। पर्याप्त पोषण सामग्री की आपूर्ति करने के लिए, समुद्री खीरे से पूर्वशोधित लौकिक तरल पदार्थ का उपयोग स्तनधारी कोशिका संस्कृति में एफबीएस के समान किया जा सकता है। इस बीच, सेल प्रसार को सुविधाजनक बनाने के लिए, संस्कृति माध्यम में कई स्तनधारी विकास कारकों को भी लागू किया जा सकता है । चूंकि ऊष्मायन तापमान समुद्री अकशेरुकी कोशिका संस्कृति की सफलता को प्रभावित करने वाला एक कारक है, इसलिए लक्ष्य जीव के इष्टतम विकास तापमान के तहत कोशिकाओं को इनक्यूबेटिंग पर विचार किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, ए जैपोनिकस सेल संस्कृति के लिए तापमान 18 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया जा सकता है, जो इसके विकास के लिए उपयुक्त है24।

ऊतक पूर्वउपचार सफलतापूर्वक सुसंस्कृत और प्रसार सेल प्रकार को प्रभावित कर सकता है। बहुत अलग ए जैपोन्कुस आंतों की कोशिकाओं, दौर या धुरी, सटीक एक ही संस्कृति प्रक्रिया के तहत छानलिया कोशिकाओं या ऊतक ब्लॉकों सीडिंग से प्राप्त किया जा सकता है (चित्रा 1 और चित्रा 3से तुलनात्मक डेटा) । इस प्रकार, विशिष्ट सेल संस्कृति प्रकार के लिए ऊतक पूर्व उपचार विधि का अनुकूलन भी शुरुआत में आयोजित किया जाना चाहिए; जैविक प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार इष्टतम प्रक्रिया का निर्णय लिया जाना चाहिए।

यहां, हमने संस्कृति में तीन दिनों के बाद ए जैपोन्कुस आंतों की कोशिकाओं में एपोप्टोसिस इंडक्शन के लिए DXMS उपचार लागू किया, और हमने एपोप्टिक सिग्नल डिटेक्शन के लिए होईसीस्ट धुंधला किया। 1 μM DXMS द्वारा 48 एच उत्तेजना के बाद Hoechst सकारात्मक कोशिकाओं का सफल पता लगाने, सुसंस्कृत कोशिकाओं के आधार पर एक जैविक प्रयोग के लिए एक व्यावहारिक उदाहरण प्रदान की है।

वर्णित प्रोटोकॉल आसानी से संभाल रहा है और एक समुद्री अकशेरुकी सेल संस्कृति की स्थापना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सुसंस्कृत कोशिकाओं को विभिन्न आगे जैविक प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए लगातार आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ जैविक सामग्री प्रदान करनी चाहिए । इसके अलावा, थोड़ा समायोजित प्रोटोकॉल प्रक्रियाएं संस्कृति के दौरान सफलतापूर्वक प्रसारित सेल प्रकारों को बदल सकती हैं और जैविक प्रयोगों के लिए विभिन्न सेल सामग्री प्रदान कर सकती हैं। इसलिए, लक्षित पशु प्रजातियों और आवश्यक सेल प्रकारों के आधार पर प्रोटोकॉल में कुछ चरणों का अनुकूलन आवश्यक होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक झेजियांग विश्वविद्यालय के प्रो निंगिंग झोउ को उनकी तकनीकी सलाह के लिए और अपनी प्रयोगशाला के उपकरणों को उपयोग के लिए उपलब्ध कराने के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं । इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या ४१८७६१५४, ४१६०६१५०, और ४१४०६१३७) और झेजियांग प्रांतीय विश्वविद्यालयों और अनुसंधान संस्थानों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष द्वारा आर्थिक रूप से समर्थित किया गया था [अनुदान संख्या २०१९JZ00007 ].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 μm filter Millipore SLVV033RS
0.22 μm filter Millipore SLGP033RB
0.25% Trypsin Genom GNM25200
100 μm filter Falcon 352360
4 cm dishes ExCell Bio CS016-0124
4% paraformaldehyde solution Sinopharm Chemical Reagent 80096618 in PBS
Benchtop Centrifuges Beckman Allegra X-30R
BeyoClick EdU-488 kit Beyotime C0071S
CaCl2 Sinopharm Chemical Reagent 10005817
Constant temperature incubator Lucky Riptile HN-3
Dexamethasone Sinopharm Chemical Reagent XW00500221
Electric thermostatic water bath senxin17 DK-S28
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent 80176961 75%
Fibroblast Growth Factor(FGF) PEPROTECH 100-18B
Fluorescent microscope Leica DMI3000B DMI3000B
Garamycin Sinopharm Chemical Reagent XW14054101
Glucose Sinopharm Chemical Reagent 63005518
Hoechst33258 Staining solution Beyotime C1017
Insulin Sinopharm Chemical Reagent XW1106168001
Insulin like Growth Factor(IGF) PEPROTECH 100-11
KCl Sinopharm Chemical Reagent 10016308
Leibovitz's L-15 Genom GNM41300
L-glutamine (100 mg/mL) Genom GNM-21051
MgCl2 Sinopharm Chemical Reagent XW77863031
Na2SO4 Sinopharm Chemical Reagent 10020518
NaCl Sinopharm Chemical Reagent 10019308
NaOH Sinopharm Chemical Reagent 10019718
PBS Solarbio P1020 pH7.2-7.4
Penicillin-Streptomycin Genom GNM15140
PH meter Bante A120
Taurine SIGMA T0625
VE Seebio 185791

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References

  1. Naganuma, T., Degnan, B. M., Horikoshi, K., Morse, D. E. Myogenesis in primary cell cultures from larvae of the abalone, Haliotis rufescens. Molecular Marine Biology and Biotechnology. 3 (3), 131-140 (1994).
  2. Reinardy, H. C., Emerson, C. E., Manley, J. M., Bodnar, A. G. Tissue regeneration and biomineralization in sea urchins: role of Notch signaling and presence of stem cell markers. Plos One. 10 (8), 0133860 (2015).
  3. Schaffer, A. A., Bazarsky, M., Levy, K., Chalifa-Caspi, V., Gat, U. A transcriptional time-course analysis of oral vs. aboral whole-body regeneration in the Sea anemone Nematostella vectensis. Bmc Genomics. 17, 718 (2016).
  4. Chiaramonte, M., Inguglia, L., Vazzana, M., Deidun, A., Arizza, V. Stress and immune response to bacterial LPS in the sea urchin Paracentrous lividus (Lamarck, 1816). Fish and Shellfish Immunology. 92, 384-394 (2019).
  5. Meng, J., Wang, T., Li, L., Zhang, G. Inducible variation in anaerobic energy metabolism reflects hypoxia tolerance across the intertidal and subtidal distribution of the Pacific oyster (Crassostrea gigas). Marine Environmental Research. 138, 135-143 (2018).
  6. Han, G., Zhang, S., Dong, Y. Anaerobic metabolism and thermal tolerance: The importance of opine pathways on survival of a gastropod after cardiac dysfunction. Integrative Zoology. 12 (5), 361-370 (2017).
  7. Zhang, X., et al. The sea cucumber genome provides insights into morphological evolution and visceral regeneration. PLoS Biology. 15 (10), 2003790 (2017).
  8. Sun, L., et al. iTRAQ reveals proteomic changes during intestine regeneration in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part D: Genomics and Proteomics. 22, 39-49 (2017).
  9. Xu, K., et al. Cell loss by apoptosis is involved in the intestinal degeneration that occurs during aestivation in the sea cucumber Apostichopus japonicus. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. 216, 25-31 (2018).
  10. Yang, H. S., et al. Metabolic characteristics of sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka) during aestivation. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 330 (2), 505-510 (2006).
  11. Xiang, X. W., et al. Glycolytic regulation in aestivation of the sea cucumber Apostichopus japonicus: evidence from metabolite quantification and rate-limiting enzyme analyses. Marine biology. 163 (8), 1-12 (2016).
  12. Jiang, L., et al. A feedback loop involving FREP and NF-kappaB regulates the immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus. International Journal of Biological Macromolecules. 135, 113-118 (2019).
  13. Zhou, X., Chang, Y., Zhan, Y., Wang, X., Lin, K. Integrative mRNA-miRNA interaction analysis associate with immune response of sea cucumber Apostichopus japonicus based on transcriptome database. Fish and Shellfish Immunology. 72, 69-76 (2018).
  14. Cai, X., Zhang, Y. Marine invertebrate cell culture: a decade of development. Journal of Oceanography. 70 (5), 405-414 (2014).
  15. Maselli, V., Xu, F., Syed, N. I., Polese, G., Di Cosmo, A. A Novel Approach to Primary Cell Culture for Octopus vulgaris Neurons. Frontiers in Physiology. 9, 220 (2018).
  16. Pinsino, A., Alijagic, A. Sea urchin Paracentrotus lividus immune cells in culture: formulation of the appropriate harvesting and culture media and maintenance conditions. Biology Open. 8 (3), (2019).
  17. Odintsova, N. A., Dolmatov, I. Y., Mashanov, V. S. Regenerating holothurian tissues as a source of cells for long-term cell cultures. Marine Biology. 146 (5), 915-921 (2005).
  18. Rastogi, R. P., Richa, R. P., Sinha, R. P. Apoptosis: Molecular Mechanisms and Pathogenicity. Excli Journal. 8, 155-181 (2009).
  19. Wan, L., et al. Apoptosis, proliferation, and morphology during vein graft remodeling in rabbits. Genetics and Molecular Research. 15 (4), (2016).
  20. Kasibhatla, S., et al. Staining of suspension cells with hoechst 33258 to detect apoptosis. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (3), (2006).
  21. Mikiewicz, M., Otrocka-Domagala, I., Pazdzior-Czapula, K., Rotkiewicz, T. Influence of long-term, high-dose dexamethasone administration on proliferation and apoptosis in porcine hepatocytes. Research in Veterinary Science. 112, 141-148 (2017).
  22. Rinkevich, B. Cell cultures from marine invertebrates: new insights for capturing endless stemness. Marine Biotechnology. 13 (3), 345-354 (2011).
  23. Bello, S. A., Abreu-Irizarry, R. J., Garcia-Arraras, J. E. Primary cell cultures of regenerating holothurian tissues. Methods in Molecular Biology. 1189, 283-297 (2015).
  24. Yu, H., et al. Impact of water temperature on the growth and fatty acid profiles of juvenile sea cucumber Apostichopus japonicus (Selenka). Journal of Thermal Biology. 60, 155-161 (2016).

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समुद्र ककड़ी आंतों की कोशिकाओं की एक प्राथमिक संस्कृति में एपोप्टोसिस प्रेरण और पता लगाने
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Wang, T., Chen, X., Xu, K., Zhang, B., Huang, D., Yang, J. Apoptosis Induction and Detection in a Primary Culture of Sea Cucumber Intestinal Cells. J. Vis. Exp. (155), e60557, doi:10.3791/60557 (2020).

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