Identifier les inhibiteurs de l'interaction HBx-DDB1 à l'aide d'un système d'assay Split Luciferase
Summary
Ici, nous présentons une méthode pour le dépistage des agents viraux anti-hépatite B qui inhibent l’interaction HBx-DDB1 à l’aide d’un système d’évaluation de la luciferase fractionnée. Ce système permet une détection facile des interactions protéines-protéines et convient à l’identification des inhibiteurs de ces interactions.
Abstract
Il y a un besoin urgent de nouveaux agents thérapeutiques pour l’infection par le virus de l’hépatite B (VHB). Bien que les analogues nucléos(t)ide actuellement disponibles inhibent puissamment la réplication virale, ils n’ont aucun effet direct sur l’expression des protéines virales transcrites à partir d’un ADN circulaire viril covalently fermé (cccDNA). Comme une charge élevée d’antigène viral peut jouer un rôle dans cette carcinogenèse chronique et liée au VHB, l’objectif du traitement du VHB est d’éradiquer les protéines virales. La protéine régulatrice du VHB X (HBx) se lie à la protéine 1 (DDB1) qui lie les dommages à l’ADN de l’hôte pour dégrader le maintien structurel des chromosomes 5/6 (Smc5/6), ce qui entraîne l’activation de la transcription virale de l’ADN-ccc. Ici, à l’aide d’un système d’analyse de complémentarité de la luciférase fractionnée, nous présentons un système complet de dépistage composé pour identifier les inhibiteurs de l’interaction HBx-DDB1. Notre protocole permet une détection facile de la dynamique d’interaction en temps réel au sein des cellules vivantes. Cette technique peut devenir un essai clé pour découvrir de nouveaux agents thérapeutiques pour le traitement de l’infection par le VHB.
Introduction
L’infection par le virus de l’hépatite B (VHB) est un problème majeur de santé publique dans le monde entier, avec des estimations annuelles de 240 millions de personnes infectées de façon chronique par le VHB et de 90 000 décès dus à des complications de l’infection, y compris la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire (HCC)1. Bien que les agents thérapeutiques anti-HBV actuels, analogues nucléos(t)ide, inhibent suffisamment la transcription inverse virale, ils atteignent rarement l’élimination des protéines virales, qui est l’objectif clinique à long terme. Leur mauvais effet sur l’élimination des protéines virales est dû à leur manque d’effet direct sur la transcription virale des minichromosomes d’ADN circulaires épisomiques covalentement fermés (cccDNA) dans le noyau d’hépatocyte2.
La transcription du VHB est activée par la protéine HBV regulatory X (HBx)3. Des études récentes ont révélé que HBx dégrade le maintien structurel des chromosomes 5/6 (Smc5/6), un facteur de restriction de l’hôte qui bloque la transcription du VHB de cccDNA, par le détournement d’un DDB1-CUL4-ROC1 E3 ubiquitin ligase complexe4,5,6. Par conséquent, une étape cruciale dans la promotion de la transcription virale de cccDNA est pensé pour être l’interaction HBx-DDB1. Les composés capables d’inhiber la liaison entre HBx et DDB1 peuvent bloquer la transcription virale, et en effet le nitazoxanide a été identifié comme un inhibiteur de l’interaction HBx-DDB1 via un système de criblage développé dans notre laboratoire7.
Ici, nous présentons notre système de criblage commode utilisé pour identifier les inhibiteurs de l’interaction HBx-DDB1, qui utilise un test complémentaire de luciferase fractionnée7,8. Les sous-unités de luciferase fendues sont fusionnées à HBx et DDB1, et l’interaction HBx-DDB1 amène les sous-unités à proximité pour former une enzyme fonctionnelle qui génère un signal luminescent lumineux. Comme l’interaction entre les sous-unités est réversible, ce système peut détecter des protéines HBx-DDB1 dissociantes rapidement dissociantes (figure 1). À l’aide de ce système, une grande bibliothèque de composés peut être facilement examinée, ce qui peut entraîner la découverte de nouveaux composés capables d’inhiber efficacement l’interaction HBx-DDB1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons développé une méthode de criblage pratique utilisant un test de luciferase split pour trouver des inhibiteurs de liaison HBx-DDB1. La dynamique d’interaction peut être détectée en temps réel dans les cellules vivantes sans avoir besoin de lyse cellulaire. L’inhibition de l’interaction HBx-DDB1 conduit à la restauration de Smc5/6, ce qui entraîne la suppression de la transcription virale, l’expression des protéines, et la production cccDNA7. Ce nouveau mécanisme d’action antiv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par Des subventions en aide du Ministère de l’éducation, Culture, Sports, Science et Technologie, Japon (#19H03430 et #17K09405 à M.O., et #19J11829 à K.S.), par une subvention pour la recherche scientifique sur les domaines innovants (#18H05024 à M.O.), par le Programme de recherche sur l’hépatite du Japon Agency for Medical Research and Development, AMED (à M.O., #JP19fk021005), par programme sur le développement innovant et l’application de nouveaux médicaments pour l’hépatite B.( #JP19fk0310102 à K.K.) la Japan Foundation for Applied Enzymology et de la Kobayashi Foundation for Cancer Research (à M.O.), par GSK Japan Research Grant 2018 (à K.S.), et par une subvention de la Miyakawa Memorial Research Foundation (à K.S.).
Materials
| Cell culture microplate, 96 well, PS, F-BOTTOM | Greiner-Bio-One GmbH | 655098 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6046 | |
| DMSO | Tocris Bioscience | 3176 | |
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | Includes DNA-condensation buffer, enhancer solution and transfection reagent |
| FBS | Nichirei | 175012 | |
| GloMax 96 microplate luminometer | Promega | E6521 | |
| HBx–LgBit expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
| NanoBiT PPI starter systems | Promega | N2015 | Includes Nano-Glo Live Cell Reagent |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 11058021 | Described as "buffered cell culture medium" in the manuscript |
| PBS | Takara | T900 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P0781 | |
| Screen-Well FDA-approved drug library V2 version 1.0 | Enzo Life Sciences | BML-2841 | Compounds used here were as follows: mequinol, mercaptopurine hydrate, mesna, mestranol, metaproterenol hemisulfate, metaraminol bitartrate, metaxalone, methacholine chloride, methazolamide, methenamine hippurate, methocarbamol, methotrexate, methoxsalen, methscopolamine bromide, methsuximide, methyclothiazide, methyl aminolevulinate·HCl, methylergonovine maleate, metolazone, metyrapone, mexiletine·HCl, micafungin, miconazole, midodrine·HCl, miglitol, milnacipran·HCl, mirtazapine, mitotane, moexipril·HCl, mometasone furoate, mupirocin, nadolol, nafcillin·Na, naftifine·HCl, naratriptan·HCl, natamycin, nebivolol·HCl, nelarabine, nepafenac, nevirapine, niacin, nicotine, nilotinib, nilutamide, nitazoxanide, nitisinone, nitrofurantoin, nizatidine, nortriptyline·HCl, olsalazine·Na, orlistat, oxaprozin, oxtriphylline, oxybutynin Chloride, oxytetracycline·HCl, paliperidone, palonosetron·HCl, paromomycin sulfate, pazopanib·HCl, pemetrexed disodium, pemirolast potassium, penicillamine, penicillin G potassium, pentamidine isethionate, pentostatin, perindopril erbumine, permethrin, perphenazine, phenelzine sulfate, phenylephrine, phytonadione, pimecrolimus, pitavastatin calcium, and podofilox |
| SmBit–DDB1 expressing DNA plasmid | Our laboratory | Available upon request | |
| Trypsin-EDTA | Sigma Aldrich | T4049 |
Referências
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