نقدم طريقه تجمع بين تنقيه البروتين الغشائي وأعاده التشكيل إلى أقراص البيتيغرافيه في خطوه واحده للكروماتوغرافي. وتستخدم السقالات الحيوية للحصول علي المرفق السطحي المباشر وقياس التفاعلات البروتينية والبروتينات عن طريق قياس التداخل الحيوي.
البروتينات الغشائية ، بما في ذلك الناقلات والقناات والمستقبلات ، تشكل ما يقرب من ربع البروتينية الخلوية وأكثر من نصف الأهداف الحالية للمخدرات. ومع ذلك ، فان أحد العوائق الرئيسية التي تحول دون توصيفها واستغلالها في الأوساط الاكاديميه أو الصناعية هو ان معظم استراتيجيات الفحص البيوكيميائية والبيوفيزيائية والدوائية تتطلب ان تكون هذه البروتينات في حاله قابله للذوبان في الماء. طور مختبرنا مؤخرا البيتيديسك ، وهو الغشاء الذي يقدم نهج “مقاس واحد يناسب الجميع” لمشكله ذوبان البروتين الغشائي. نقدم هنا بروتوكولا مبسطا يجمع بين تنقيه البروتين وأعاده تشكيل البيتيديسك في خطوه واحده للكروماتوغرافي. هذا سير العمل ، وتسمي PeptiQuick ، يسمح لتجاوز غسيل الكلي والحضانة مع الخرز البوليسترين ، التالي الحد بشكل كبير من التعرض للتنظيف ، والبروتين التشبع ، وفقدان العينة. عندما يتم تنفيذ PeptiQuick مع السقالات الحيوية ، يمكن ربط الاعداد مباشره بالأسطح المغطية بالمكورات العقديه. ليست هناك حاجه إلى التعكر الحيوي أو تعديل هدف البروتين الغشاء. يتم عرض PeptiQuick هنا مع مستقبلات الغشاء FhuA ومضادات الميكروبات الليكوليسين M ، وذلك باستخدام قياس التداخل بالشكل الدقيق لتحديد الحركية الدقيقة للتفاعل بينهما. ويخلص إلى ان PeptiQuick هو وسيله مريحه لاعداد وتحليل غشاء البروتين-ligand التفاعلات في غضون يوم واحد في بيئة خاليه من المنظفات.
وغالبا ما تستبعد البروتينات غشاء من المخدرات أو الأجسام المضادة اكتشاف البرامج البحثية بسبب الميل من البروتينات الغشاء لتجميع خارج البيئة الدهنية الطبقات ، وخاصه في وجود المنظفات1. ولذلك ، في السنوات الاخيره ، تم تطوير العديد من المحاكاة الغشائية (تسمي السقالات) لتسهيل العزلة والاستجواب من البروتينات الغشائية في بيئة خاليه تماما من المنظفات (اي ، أقراص النانو ، SMALPs ، البرمائيات ، الخ) 2،3،4،5،6. ومع ذلك ، فان أعاده تكوين البروتينات الغشائية في هذه الميميتيكس غالبا ما يتطلب التحسين الشامل ، والذي يستغرق وقتا طويلا ويرافقه عموما مع فقدان البروتين الانتعاش7،8. وللتغلب علي هذه القيود ، طور مختبرنا مؤخرا صيغه “مقاس واحد يناسب الجميع” تعرف باسم بيبتيديسك9. يتم تشكيل peptidisc عندما نسخ متعددة من مصمم 4.5 ده البرمائية البرمائيات ربط الببتيد إلى سطح مسعور من بروتين الغشاء المستهدف. أعاده مستقره في البيتيديسك يحدث عند أزاله المنظفات ، والدخول علي حد سواء الدهون الذاتية والبروتينات الغشاء solubilized في جزيئات قابله للذوبان في الماء. هذه الجزيئات استقرت الآن قابله للعديد من التطبيقات المصب.
طريقه peptidisc يقدم العديد من المزايا; علي سبيل المثال ، أعاده التشكيل واضحة ، حيث ان ربط سقالة البيتيديسك علي الهدف يسترشد بقالب البروتين نفسه9،10. القياس الببتيد هو أيضا تحديد الذات ، وأضافه الدهون الخارجية ليس من الضروري. تكوين البيتيديسك يحدث عن طريق تخفيف المنظفات بسيطه ، ميزه هامه علي غسيل الكلي أو الامتزاز علي الخرز البوليسترين ، والتي غالبا ما تؤدي إلى انخفاض البروتين الغلة بسبب غير محدده الجمعية السطحية والتجميع11،12 ،13. الجمعية بيبتيديسك النهائي هو حراريا للغاية وقابل للذوبان دائما في مخازن مختلفه أو في وجود الكاتيونات ثنائي التكافؤ (علي سبيل المثال ، Ni2 +). نقاء وتجانس الهيكلية للسقالة هو أيضا عاليه (علي سبيل المثال ، اندوتوكسين خاليه) ، ويمكن تخصيص الببتيد مع المجموعات الوظيفية وضعت في مواقف مختلفه.
نحن نقدم هنا سير عمل المختبر يسمي PeptiQuick ، والمعروف أيضا باسم الخرز أعاده تشكيل9. يجمع هذا البروتوكول بين تنقيه البروتين الغشائي وأعاده تكوين البيتيديسك في خطوه واحده وعلي نفس الدعم الكروماتوغرافي. وكما يشير الاسم ، فان PeptiQuick سريع مقارنه بطرق أعاده التشكيل الأخرى ، كما انه يقلل بشكل خطير من وقت التعرض للتنظيف. اثار المنظفات السلبية مثل البروتين تتكشف والتراكم غالبا ما تحدث بطريقه تعتمد علي الوقت; لذلك ، التقليل من التعرض للتنظيف أمر بالغ الاهميه للمحافظة علي البروتين الأصلي14،15. وهذا أمر بالغ الاهميه لدقه الطرق التي تبلغ عن تفاعلات البروتين وأوجه التقارب الملزمة.
اثناء تطوير هذا البروتوكول ، ونحن نقدم رواية النسخة الحيوية من سقالة peptidisc ، وتسمي بيو بيبتيديسك. المجموعات الوظيفية البيوتين تسمح المرفق من البروتين الغشاء المستهدف علي الأسطح المغلفة العقديات. منذ الوسم البيوتين يقتصر علي سقالة ، ومواقع ملزمه علي البروتين الغشاء الهدف تبقي دون تغيير. باستخدام بيو-بيبتيديسك ، يتم تحديد حركيه ملزمه من مستقبلات الغشاء البكتيري FhuA ومضادات الميكروبات كوليسين M (ColM)16. ويقاس هذا التقارب عن طريق قياس التداخل البسيط (BLI) ، الذي يحلل التفاعلات في الوقت الحقيقي استنادا إلى أنماط تداخل الضوء الأبيض المنعكسة من طرف مستشعر.
باستخدام هذا البروتوكول ، يتم التخلص من الحاجة إلى المنظفات اثناء تحليل BLI ، وهو تطور مهم ، حيث ان المنظفات يمكن ان تعطل التفاعلات. ويمكن قياس أوجه التقارب الملزمة بسرعة بهذه الطريقة ، وتكون النتائج مماثله لتلك التي ابلغ عنها في وقت سابق باستخدام أقراص النانو والمعايرة الحرارية للقياس الحجمي (ITC)16. يتم عرض الخطوات الهامه في سير العمل PeptiQuick ومناقشتها ، مثل اعداد البروتين ، وتخفيف المنظفات ، وأضافه الببتيد ، وأعاده التشكيل ، إلى جانب نصائح لاستكشاف الأخطاء المرتبطة بالربط والتحلل في فحص BLI. باستخدام سير العمل PeptiQuick ، وجد ان البروتينات الغشائية يمكن التقاطها في أقراص البيتينات وتفاعلاتها تقاس في غضون يوم واحد.
في حين تبقي المنظفات ابسط طريقه لاستخراج وتنقيه البروتينات الغشائية ، يمكن ان يكون لهذه السطحية العديد من الآثار غير المرغوب فيها علي استقرار البروتين ، وظيفة ، وتحليلات المصب1،2،3، 4،5،6،7،8،9. وقد حفزت هذه الصعوبات تطوير الاغشيه الغشائية ، والتي تسعي إلى التقليل من وجود المنظفات وتكرار بيئة الغشاء الأصلي قدر الإمكان2،3،4 و5و6. بيد ان غالبيه أساليب أعاده التشكيل تتطلب تحسينا كبيرا في ظروف أعاده التشكيل وكثيرا ما تتطلب خطوات تنقيه اضافيه ، مما يخفض العائد النهائي7و8. و peptidisc تتكيف تلقائيا مع البروتين الغشاء الهدف ونسبيا ، يتطلب التحسين قليلا وتنقيه المصب9،10. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم PeptiQuick كوسيلة بسيطه لتبسيط بروتوكول أعاده التشكيل لتحليل تفاعل البروتين والبروتين المصب.
علي الرغم من ان واضحة ، وهناك العديد من المحاذير التجريبية التي يمكن ان تؤدي إلى أعاده تشكيل غير ناجحه. من بين هذه, الأكثر شيوعا ويرجع ذلك إلى تراكم البروتين. ولذلك فمن الاهميه بمكان اجراء الفصل اللوني لاستبعاد الحجم لرصد عمليه أعاده التشكيل. علي سبيل المثال ، حجم الاستبعاد الذروة التملص في حجم الفراغ يدل علي مجاميع البروتين (الشكل 3 ب)17،18. تتشكل مجاميع البروتين الغشائي عاده عند التعرض لفترات طويلة لظروف المنظفات دون الأمثل قبل أعاده التشكيل. علي وجه الخصوص ، تم العثور علي ان البروتينات الغشائية في المنظفات تميل إلى تشكيل المجاميع عندما تتركز عن طريق الترشيح الفائق علي أجهزه الطرد المركزي. في هذه الحالة ، يمكن ان تتركز البروتينات الغشاء الحساسة باستخدام فراغ فائقه الترشيح ، وهو أسلوب الطف وأكثر تجانسا من التركيز منذ الامتزاز من البروتينات إلى فلتر يتناقص.
بشكل عام ، لتجنب تركيز البروتين ، يجب تجميع كسور IMAC التي لا يمكن التملص منها ، وحقن القرص الصغير في عمود استبعاد الحجم للتحقق من جوده التشكيل. وتجدر الاشاره إلى ان الحرة غير المدمجة الببتيد التملص فقط بعد ذروه peptidisc الرئيسي (الشكل 3B). السقالة الحرة لا تعيق بالضرورة التجارب المصب. ومع ذلك ، إذا لزم الأمر ، يمكن أزاله هذا الفائض بواسطة اللوني استبعاد الحجم. بدلا من ذلك ، وزيادة حجم الغسيل اثناء أعاده تشكيل ، وقبل التملص من الراتنج ايماك ، هو ما يكفي لأزاله بشكل فعال معظم الببتيد بيبتيديسك الحرة. لذلك ، يوصي بالفصل اللوني لاستبعاد الحجم كوسيلة سريعة وبسيطه للتحقق من جوده أعاده التشكيل.
تتطلب تجربه BLI التحسين الدقيق لتركيزات الربط والتحاليل. يجب ان يكون ربط ligand كافيه للحصول علي اشاره واضحة ، ولكن الحمولة الزائدة سوف يسبب تشبع الاشاره ، مما يؤدي إلى التحف البيانات من الاكتظاظ والعوائق فراغي علي سطح الطرف. ولذلك ، فان كلا من تركيز الربط وطول الوقت الذي ينفقه الطرف في الحل يجب ان يكون أمثل لكل عينه بروتين (الشكل التكميلي 2). ويجب أيضا تحسين تركيز التحاليل. إذا كانت ثابته التفكك معروفه ، تصبح هذه الخطوة أسهل ، لأنه يمكن تقريب نطاق التركيز. نقطه انطلاق جيده لهذا التحليل هو استخدام تركيزات البروتين بين 0.1-و 20-اضعاف المتوقع19د. ك.
بعد الحصول علي بيانات BLI ، يجب اجراء تحليل دقيق للبيانات لتجنب سوء التفسير. يعتمد حساب ثابت التفكك علي احتواء منحني الربط. الا إذا كانت القياسات إلزاميه الملزمة معروفه بالفعل ، يجب استخدام نموذج التفاعل الكلاسيكي 1:1 ثنائيه الجزيئات للتركيب الاولي. وتجدر الاشاره إلى ان المنحني الملزم غير المتجانس غالبا ما يكون نتيجة للسلوك الحرفي والسلوك غير المثالي الناجم عن ارتفاع تركيز التحاليل ، والذي يمكن تفسيره بأنه نموذج ملزم معقد. ولذلك ، خفض تركيز التحليلية حتى يعرض التشكيل الجانبي sensorgram 1:1 قياس الانحناء ربط يمكن ان تساعد علي التفريق بين الربط غير المتجانسة من التفاعلات أكثر تعقيدا. ثم يتم خصم اي بيانات الربط غير المتجانسة المتبقية كما هو مبين في الشكل 420.
في هذا التقرير ، يتم قياس ثابت التفكك من 2.28 ± 0.74 nM للتفاعل ColM FhuA. هذه القيمة متوافقة مع ثابت التفكك المحدد سابقا في مجموعتنا مع نانوديسك أو البيتيديسك باستخدام مركز التجارة الكترونيه أو MST ، علي التوالي (الشكل 4e)16. يوفر هذا التناسق الثقة حول أعاده تكوين البيكتيديسك وتحليل BLI كوسيلة لتحديد حركيه التفاعل. الأهم من ذلك ، تجدر الاشاره إلى ان البروتينات عاده ما يتم تعبئتها علي المواد البيولوجية العقديات اما عن طريق الربط الكيميائي البيوتين أو بالاضافه إلى موقع محدده باستخدام e. القولونية البيوتين البيره21. من الواضح ان التعكر الحيوي لسقالة البيتيديسك ، بدلا من البروتين الغشاء المستهدف ، له العديد من المزايا. الحيوية سقالة يوفر الوقت ويقلل من القدرة علي تعطيل المواقع الهامه البروتين ملزمه. وقد وجدنا أيضا ان PeptiQuick ينطبق علي مجموعه واسعه من الطبقات المستهدفة البروتين ، بما في ذلك مستقبلات G-البروتين المقرونة (GPCRs) ، قنوات أيون ، والبروتينات غشاء β-برميل. بشكل عام ، تجدر الاشاره إلى ان استخراج المنظفات الاوليه من البروتينات الغشائية في حاله الكلي الحرة أمر بالغ الاهميه ، وان أعاده التشكيل الفوري في peptidisc يقلل من مشاكل التجميع المصب. ونظرا للبساطة ، فانه من المتصور انه سيتم توسيع peptiquick ليشمل الاختبارات الملزمة الأخرى المستندة إلى العقديات ، مثل رنين البلازمون سطحي السطحي (موارد الاستخدام الخاصة) ، واختبارات اليسا ، والتقارب بين السحب باستخدام خرز سترافيدين.
The authors have nothing to disclose.
نشكر مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا. JS يحمل منحه CGS-M CIHR. وكانت الشركة مدعومة بشراكه التدريب علي الدكتوراه في العلوم البيولوجية والبيولوجيا التي يمولها مجلس بحوث التكنولوجيا الحيوية [المرجع المتعلق بمنحه التدريب BB/M009122/1]. FD هو المستوي الثاني كندا كرسي البحوث.
30 kDa cut-off centrifugal concentrator | Millipore Sigma | C7715 | – |
Ampicillin | BioShop | 69-52-3 | Sodium Salt |
Bio-Peptidisc Peptide | Peptidisc Biotech | https://peptidisc.com | – |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | 9048-46-8 | Lyophilized powder |
CaCl2 | Fisher Chemical | 10035-04-8 | Certified ACS |
EDTA | BioShop | 6381-92-6 | Biotechnology Grade |
Ettan LC (AKTA) | Amersham Pharmacia Biotech | 18-1145-58 | – |
Glucose | BioShop | 50-99-7 | Anhydrous, Reagent Grade |
Glycerol | Fisher Chemical | 56-81-5 | Certified ACS |
Imidazole | BioShop | 288-32-4 | Biotechnology Grade |
Lauryldimethylamine oxide (LDAO) | Sigma | 101822204 | ~30% in H2O |
MgSO4 | Fisher Chemical | 10034-99-8 | Certified ACS |
Microfluidizer | Microfluidics | M-110L | Fit with F20Y 75µ diruption chamber |
Ni-NTA Resin | Gold Biotechnology | H-320-50 | – |
Non-binding 96well BLI Plate | Greiner Bio-one | 655076 | Microplate, PS, 96 well, F-Bottom (chimney well), Black, Fluotrac, Med. Binding |
Octet Red96 | FortéBio | OCTET RED96E-GxP | Octet RED96e instrument, Octet CFR software, desktop computer, LC monitor, accessory kit, IQ/OQ kit, PQ Kits and one-year warranty |
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | Sigma | P-7626 | – |
Protein Assay Dye – Reagent Concentrate | Bio-Rad | 5000006 | Used in the bradford assay to determine protein concentration – 5x concentration |
Sodium Chloride (NaCl) | BioShop | 7647-14-5 | Biotechnology Grade |
Streptavidin (SA) Biosensors | ForteBio | 18-5019 | One tray of 96 biosensors coated with streptavidin for quantitation, screening, or kinetic applications. |
Superdex S200 (300/10) | Amersham Pharmacia Biotech | 175175-01 | – |
Thiamine | Merck | 69271 | – |
Tris-HCl | BioShop | 77-86-1 | Reagent Grade |
Triton X-100 | BioShop | 900998-1 | Biotechnology Grade |
Tween-20 | BioShop | 56-40-6 | Reagent Grade |
Ultra centrifuge | Beckman Coulter | 365668 | – |