植物病原体分泌效应器中RNA沉默抑制器的筛选和鉴定
Summary
在这里，我们提出了一种经过改良的筛选方法，该方法可广泛用于快速筛选植物病原体中的RNA沉默抑制剂。
Abstract
RNA沉默是真核生物中一种进化保存的序列特异性基因调控机制。几种植物病原体已经进化出蛋白质，能够抑制宿主植物RNA沉默途径。与病毒效应蛋白不同，只有几种分泌效应蛋白显示出抑制细菌、卵母细胞和真菌病原体中RNA沉默的能力，大多数效应器的分子功能在很大程度上仍不得而知。在这里，我们详细介绍了共渗透测定的稍作修改版本，可作为观察RNA沉默和描述植物病原体分泌的效应蛋白的通用方法。该方法的关键步骤是选择健康且完全发育的叶子，在 600 nm 处将细菌培养值调整为适当的光学密度 （OD），并在渗透的最佳时间观察绿色荧光蛋白 （GFP） 荧光叶，以避免省略抑制活性较弱的效应器。这种改进的修饰方案将有助于快速、准确和广泛的RNA沉默抑制剂的筛选，并作为研究这些蛋白质的分子功能的一个极好的起点。
Introduction
在过去的二十年里，导致植物疾病的微生物基因组测序的加速导致了序列信息与编码蛋白1的生物功能之间的知识差距越来越大。在测序项目揭示的分子中，有抑制先天免疫和促进宿主殖民化的效应分子;这些因素由破坏性的植物病原体分泌，包括细菌、线虫和丝状微生物。为了应对这些威胁，宿主植物已经进化出新的受体来识别这些效应者，从而恢复免疫反应。因此，效应器受到各种选择性压力，导致病原体谱系中的效应器谱系多样化。近年来，植物病原体的假定效应器已被证明会破坏植物先天免疫，阻碍宿主细胞过程，使微生物以各种方式受益，包括信号通路调节失调、转录、细胞内迁移、细胞骨架稳定性、囊泡贩运和RNA沉默3、4、5。然而，绝大多数病原体效应者，特别是来自丝状病原体的病原体，仍然神秘莫测。
RNA沉默是一种同源介导的基因失活机制，在真核生物中保存。这个过程由长双链RNA（dsRNA）触发，以序列特异性的方式瞄准同源单链RNA（ssRNA），并操纵广泛的生物过程，包括抗病毒防御6。为了克服宿主的先天免疫反应，一些病毒已经进化，以抵消RNA沉默，包括能够在细胞内腔内复制或从沉默重组信号中逃脱的能力。然而，病毒保护其基因组免受RNA沉默依赖基因功能丧失的最普遍策略是编码抑制RNA沉默的特异性蛋白质。已经建立了几种机械不同的方法来筛选和表征RNA沉默（VSRs）的病毒抑制剂，包括共同渗透的农业细菌，表达假定抑制剂的转基因植物，移植和细胞培养9，10，11，12，13。
每种检测都有优缺点，并且以自己独特的方式识别 VSR。最常见的方法之一是基于个体A.tmuefaes培养物的共同渗透，这种培养物蕴藏着潜在的病毒蛋白和报告基因（通常是绿色荧光蛋白[GFP]）在尼科蒂亚纳本查米亚纳16c植物的构成下在花椰菜马赛克病毒35S启动子的控制下表达GFP。在没有活性病毒沉默抑制器的情况下，GFP被宿主细胞识别为外源性，并在渗透后3天内沉默（dpi）。相比之下，如果病毒蛋白具有抑制活性，GFP的表达水平稳定在3~9 dpi9以上。这种共渗透测定简单快捷;然而，它既不高度稳定，也不敏感。尽管如此，该测定已经鉴定出许多VSR具有不同的蛋白质序列和结构在许多RNA病毒7，8。
最近，几种能抑制细胞RNA沉默活性的效应蛋白已被细菌、卵母细胞和真菌植物病原体14、15、16所制成。这些发现表明，RNA沉默抑制是大多数王国的病原体使用的常见策略，促进感染。从理论上讲，许多（如果不是全部）效应器可能编码RNA沉默抑制器（RSS）;然而，迄今为止，只确定了少数，主要原因是缺乏可靠和一般性的筛查战略。此外，在绝大多数植物病原体中，尚未对RNA沉默抑制器进行研究。
在本报告中，我们提出了一个优化的一般方案，用于识别植物病原体效应器，该效应器可以使用农业渗透测定抑制局部和系统性RNA沉默。本研究的首要目标是强调协议的关键方面，并详细描述步骤，从而提供适合几乎所有植物病原体效应物的筛选测定。
Protocol
Representative Results
Discussion
RNA沉默是植物对抗病毒、细菌、卵母和真菌病原体的关键防御机制。反过来，这些微生物已经进化了沉默抑制蛋白，以抵消抗病毒沉默，这些RSS干扰RNA沉默途径22，23的不同步骤。已经开发了几种筛选检测，以识别RSS10。
在这里，我们描述了一种改进的协议，用于筛选P.sojae在感染时分泌到宿主细胞中的有效?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了上海市教育发展基金会”曙光计划”和上海市教委、国家重点研发项目国家重点研发项目的资助。2018YFD0201500），国家自然科学基金（第31571696号，31660510号），中国青年专业人才千人计划，上海市科委（18DZ2260500）。
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
Referências
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