فحص وتحديد مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي من المؤثرات المفرزة من مسببات الأمراض النباتية
Summary
هنا ، نقدم طريقة فحص معدلة يمكن استخدامها على نطاق واسع لفحص مثبطات إسكات الحمض النووي الريبي بسرعة في مسببات الأمراض النباتية.
Abstract
RNA إسكات هو حفظ تطوريا، آلية تنظيم الجينات تسلسل محددة في eukaryotes. وقد تطورت العديد من مسببات الأمراض النباتية البروتينات مع القدرة على تثبيط مسار إسكات الحمض النووي الريبي النبات المضيف. على عكس بروتينات تأثير الفيروسات ، أظهرت العديد من بروتينات المؤثرات المعسرة القدرة على قمع إسكات الحمض النووي الريبي في مسببات الأمراض البكتيرية والأوميسيتة والفطرية ، ولا تزال الوظائف الجزيئية لمعظم المؤثرات غير معروفة إلى حد كبير. هنا ، نصف بالتفصيل نسخة معدلة قليلا من تحليل التسلل المشترك التي يمكن أن تكون بمثابة طريقة عامة لمراقبة إسكات الحمض النووي الريبي وتوصيف البروتينات المؤثرات التي تفرزها مسببات الأمراض النباتية. الخطوات الرئيسية للنهج هي اختيار أوراق صحية ومكتملة النمو ، وضبط ثقافة البكتيريا إلى الكثافة البصرية المناسبة (OD) في 600 نانومتر ، ومراقبة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) الفلورية في الوقت الأمثل على المتسللين يترك من أجل تجنب حذف المؤثرات مع ضعف نشاط القمع. هذا البروتوكول المحسن سيساهم في الفحص السريع والدقيق والمكثف للكتمات الإسكات الجيش الملكي النيبالي وبمثابة نقطة انطلاق ممتازة للتحقيق في الوظائف الجزيئية لهذه البروتينات.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين، أدى التسارع في تسلسل الجينوم من الكائنات الحية الدقيقة التي تسبب أمراض النباتات إلى فجوة معرفية متزايدة من أي وقت مضى بين المعلومات تسلسل والوظائف البيولوجية للبروتينات المشفرة1. ومن بين الجزيئات التي كشفت عنها مشاريع التسلسل جزيئات المؤثرات التي تقمع المناعة الفطرية وتيسر الاستعمار المضيف؛ تفرز هذه العوامل من قبل مسببات الأمراض النباتية المدمرة، بما في ذلك البكتيريا، والديدان الخيطية، والميكروبات الخيطية. وللاستجابة لهذه التهديدات، طورت النباتات المضيفة مستقبلات جديدة تتعرف على هذه المؤثرات، مما يتيح استعادة الاستجابة المناعية. وبالتالي ، تخضع المؤثرات لضغوط انتقائية مختلفة ، مما يؤدي إلى تنويع ذخيرة التأثير بين الأنساب المسببة للأمراض2. في السنوات الأخيرة ، ثبت أن المؤثرات المفترضة من مسببات الأمراض النباتية تعطل المناعة الفطرية النباتية عن طريق إعاقة العمليات الخلوية المضيفة لصالح الميكروبات بطرق متنوعة ، بما في ذلك خلل تنظيم مسارات الإشارات ، والنسخ ، والنقل داخل الخلايا ، واستقرار الهيكل الخلوي ، والاتجار بالحويز ، والحمض النووي الريبي إسكات3،4،5. ومع ذلك ، فإن الغالبية العظمى من مسببات الأمراض ، ولا سيما تلك من مسببات الأمراض الخيطية ، ظلت غامضة.
RNA إسكات هو جهاز تنشيط الجينات بوساطة homology التي يتم حفظها بين eukaryotes. يتم تشغيل هذه العملية من قبل الحمض النووي الريبي طويل تقطعت بهم السبل مزدوجة (dsRNA) ويستهدف الحمض النووي الريبي المتماثل واحد تقطعت بهم السبل (ssRNA) بطريقة تسلسل محددة، وأنه يتلاعب مجموعة واسعة من العمليات البيولوجية، بما في ذلك الدفاع المضادة للفيروسات6. للتغلب على الاستجابات المناعية الفطرية للمضيف ، تطورت بعض الفيروسات لتعويض إسكات الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك القدرة على تكرار داخل المقصورات داخل الخلايا أو الهروب من الإشارة المعاد تنظيمها. ومع ذلك ، فإن الاستراتيجية الأكثر عمومية التي تحمي الفيروسات جينومها ضد فقدان الحمض النووي الريبي المعتمد على وظيفة الجينات هو ترميز بروتينات محددة تقمع RNA إسكات7،8. وقد أنشئت عدة نهج مختلفة ميكانيكيا لفحص وتوصيف المكثفات الفيروسية من إسكات الجيش الملكي النيبالي (VSRs)، بما في ذلك التسلل المشترك للثقافات كيتومالونز Agrobacterium، والنباتات المعدلة وراثيا التعبير عن القامع المفترضة، والتطعيم وثقافة الخلية9،10،11،12، 13.
كل من هذه المقالات المحددة لها مزايا وعيوب، وتحدد VSRs بالطريقة الخاصة بها. ويستند أحد النهج الأكثر شيوعا على التسلل المشترك للثقافات A. tmuefaciens الفردية التي تؤوي البروتين الفيروسي المحتمل والجينات مراسل (عادة البروتين الفلوري الأخضر [GFP]) على النباتات Nicotiana benthamiana 16c تشكل تشكيلGFP تحت سيطرة القرنبيط فسيفساء فيروس 35S المروج. في حالة عدم وجود مثبط إسكات فيروسي نشط ، يتم تحديد GFP على أنه خارجي من قبل الخلايا المضيفة ويتم إسكاته في غضون 3 أيام بعد التسلل (نقطة في البوصة). وعلى النقيض من ذلك، إذا كان البروتين الفيروسي يمتلك نشاط الكبت، فإن مستوى التعبير عن GFP يظل ثابتاً بعد 3−9 نقطة في البوصة9. هذا النسخة المشتركة من عملية التتسلل بسيطة وسريعة. ومع ذلك ، فإنه ليس مستقرا للغاية ولا حساسة. ومع ذلك ، فقد حددت في إجراء العديد من VSRs مع تسلسل البروتين المتنوعة والهياكل في العديد من فيروسات الجيش الملكي النيبالي7،8.
في الآونة الأخيرة ، تم وصف العديد من البروتينات المؤثرات التي يمكن أن تمنع نشاط إسكات الحمض النووي الريبي الخلوي من البكتيريا ، الأوميسيت ، ومسببات الأمراض النباتية الفطرية14،15،16. هذه النتائج تعني أن قمع الجيش الملكي النيبالي هو استراتيجية مشتركة لتسهيل العدوى التي تستخدمها مسببات الأمراض في معظم الممالك. من الناحية النظرية، قد العديد، إن لم يكن كل، من المؤثرات ترميز مثبطات إسكات الجيش الملكي النيبالي (RSSs)؛ غير أنه لم يتم حتى الآن تحديد سوى عدد قليل منها، ويرجع ذلك أساسا إلى نقص استراتيجية الفرز العامة الموثوقة. وعلاوة على ذلك، لم يتم التحقيق في مثبطات من إسكات الجيش الملكي النيبالي في الغالبية العظمى من مسببات الأمراض النباتية17.
في هذا التقرير، نقدم بروتوكولًا مثاليًا وعامًا لتحديد تأثيرات مسببات الأمراض النباتية التي يمكن أن تقمع إسكات الحمض النووي الريبي المحلي والنظامي باستخدام فحص التسلل الزراعي. وكان الهدف الأول من هذه الدراسة هو التأكيد على الجوانب الرئيسية للبروتوكول ووصف الخطوات بالتفصيل، وبالتالي توفير فحص للفحص يناسب تقريباً جميع تأثيرات مسببات الأمراض النباتية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجيش الملكي النيبالي إسكات هو آلية الدفاع الرئيسية المستخدمة من قبل النباتات لمكافحة الفيروسية والبكتيرية والأوميسيت، ومسببات الأمراض الفطرية. بدورها ، تطورت هذه الميكروبات إسكات البروتينات المكثفة لمواجهة إسكات المضادة للفيروسات ، وهذه RSSs تتداخل مع خطوات مختلفة من مسار إسكات الحمض ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح من “برنامج شوقوانغ” لمؤسسة تطوير التعليم في شنغهاي ولجنة التعليم لبلدية شنغهاي، والبرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في الصين ( 2018YFD0201500)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 31571696 و 31660510)، وبرنامج الألف مواهب للمهنيين الشباب في الصين، ولجنة العلوم والتكنولوجيا في بلدية شنغهاي (18DZ2260500).
Materials
| 2-Morpholinoethanesulfonic Acid (MES) | Biofroxx | 1086GR500 | Buffer |
| 2xTaq Master Mix | Vazyme Biotech | P112-AA | PCR |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS) | Amresco | 0264C507-1KG | MOPS Buffer |
| Acetosyringone (AS) | Sigma-Aldrich | D134406-5G | Induction of Agrobacterium |
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | LB medium |
| Agarose | Biofroxx | 1110GR100 | Electrophoresis |
| Amersham Hybond -N+ | GE Healthcare | RPN303 B | Nothern blot |
| Amersham Imager | GE Healthcare | Amersham Imager 600 | Image |
| Bacto Tryptone | BD Biosciences | 211705 | LB medium |
| Bacto Yeast Extraction | BD Biosciences | 212750 | LB medium |
| Camera | Nikon | D5100 | Photography |
| ChemiDoc MP Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chemiluminescent detection module component of dafa kits | Thermo Fisher Scientific | 89880 | Luminescence detection |
| Chloramphenicol | Amresco | 0230-100G | Antibiotics |
| ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme Biotech | C112-01 | Ligation |
| DIG Easy Hyb | Sigma-Aldrich | 11603558001 | Hybridization buffer |
| Easypure Plasmid Miniprep kit | TransGen Biotech | EM101-02 | Plasmid Extraction |
| EasyPure Quick Gel Extraction Kit | TransGen Biotech | EG101-02 | Gel Extraction |
| EDTA disodium salt dihydrate | Amresco/VWR | 0105-1KG | MOPS Buffer |
| Electrophoresis Power Supply | LiuYi | DYY6D | Nucleic acid electrophoresis. |
| FastDigest EcoRV | Thermo Fisher Scientific | FD0304 | Vector digestion |
| Gel Image System | Tanon | Tanon3500 | Image |
| Gentamycin | Amresco | 0304-5G | Antibiotics |
| Kanamycin Sulfate | Sigma-Aldrich | K1914 | Antibiotics |
| LR Clonase II enzyme | Invitrogen | 11791020 | LR reaction |
| Nitrocellulose Blotting membrane 0.45um | GE Healthcare | 10600002 | Northern |
| NORTH2south biotin random prime dna labeling kit | Thermo Fisher Scientific | 17075 | Biotin labeling |
| PCR Thermal Cyclers | Bio-Rad | T100 | PCR |
| Peat moss | PINDSTRUP | Dark Gold + clay | Plants |
| Peters Water-Soluble Fertilizer | ICE | Peter Professional 20-20-20 | Fertilizer |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme Biotech | P505-d1 | Enzyme |
| Rifampicin | MP Biomedicals | 219549005 | Antibiotics |
| RNA Gel Loading Dye (2X) | Thermo Fisher Scientific | R0641 | RNA Gel Loading Dye |
| Sodium Acetate Hydrate | Amresco/VWR | 0530-1KG | MOPS Buffer |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241-10KG | LB medium |
| Tri-Sodium citrate | Amresco | 0101-1KG | SSC Buffer |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation reagent |
| UV lamp | Analytik Jena | UVP B-100AP | Observation |
| UVP Hybrilinker Oven | Analytik Jena | OV2000 | Northern |
Referências
- Waterfield, N. R., et al. Rapid Virulence Annotation (RVA): identification of virulence factors using a bacterial genome library and multiple invertebrate hosts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15967-15972 (2008).
- Rovenich, H., Boshoven, J. C., Thomma, B. P. Filamentous pathogen effector functions: of pathogens, hosts and microbiomes. Current Opinion in Plant Biology. 20, 96-103 (2014).
- Varden, F. A., De la Concepcion, J. C., Maidment, J. H., Banfield, M. J. Taking the stage: effectors in the spotlight. Current Opinion in Plant Biology. 38, 25-33 (2017).
- Lee, A. H., et al. Identifying Pseudomonas syringae Type III Secreted Effector Function via a Yeast Genomic Screen. G3: Genes, Genomes, Genetics. 9 (2), 535-547 (2019).
- Toruno, T. Y., Stergiopoulos, I., Coaker, G. Plant-Pathogen Effectors: Cellular Probes Interfering with Plant Defenses in Spatial and Temporal Manners. Annual Review of Phytopathology. 54, 419-441 (2016).
- Baulcombe, D. RNA silencing in plants. Nature. 431 (7006), 356-363 (2004).
- Pumplin, N., Voinnet, O. RNA silencing suppression by plant pathogens: defence, counter-defence and counter-counter-defence. Nature Reviews Microbiology. 11 (11), 745-760 (2013).
- Csorba, T., Kontra, L., Burgyan, J. Viral silencing suppressors: Tools forged to fine-tune host-pathogen coexistence. Virology. 479-480, 85-103 (2015).
- Johansen, L. K., Carrington, J. C. Silencing on the spot. Induction and suppression of RNA silencing in the Agrobacterium-mediated transient expression system. Plant Physiology. 126 (3), 930-938 (2001).
- Powers, J. G., et al. A versatile assay for the identification of RNA silencing suppressors based on complementation of viral movement. Molecular Plant-Microbe Interactions. 21 (7), 879-890 (2008).
- Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167 (2000).
- Deleris, A., et al. Hierarchical action and inhibition of plant Dicer-like proteins in antiviral defense. Science. 313 (5783), 68-71 (2006).
- Li, W. X., et al. Interferon antagonist proteins of influenza and vaccinia viruses are suppressors of RNA silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1350-1355 (2004).
- Navarro, L., et al. A plant miRNA contributes to antibacterial resistance by repressing auxin signaling. Science. 312 (5772), 436-439 (2006).
- Qiao, Y., et al. Oomycete pathogens encode RNA silencing suppressors. Nature Genetics. 45 (3), 330-333 (2013).
- Yin, C., et al. A novel fungal effector from Puccinia graminis suppressing RNA silencing and plant defense responses. New Phytologist. 222 (3), 1561-1572 (2019).
- Zhang, P., et al. The WY domain in the Phytophthora effector PSR1 is required for infection and RNA silencing suppression activity. New Phytologist. 223 (2), 839-852 (2019).
- Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions. Nature Methods. 8 (10), 785-786 (2011).
- Earley, K. W., et al. Gateway-compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. Plant Journal. 45 (4), 616-629 (2006).
- Woodman, M. E., Savage, C. R., Arnold, W. K., Stevenson, B. Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR). Current Protocols in Microbiology. 42 (1), 1-7 (2016).
- Cao, X., et al. Identification of an RNA silencing suppressor from a plant double-stranded RNA virus. Journal of Virology. 79 (20), 13018-13027 (2005).
- Burgyan, J., Havelda, Z. Viral suppressors of RNA silencing. Trends in Plant Science. 16 (5), 265-272 (2011).
- Incarbone, M., Dunoyer, P. RNA silencing and its suppression: novel insights from in planta analyses. Trends in Plant Science. 18 (7), 382-392 (2013).
- Martinez-Priego, L., Donaire, L., Barajas, D., Llave, C. Silencing suppressor activity of the Tobacco rattle virus-encoded 16-kDa protein and interference with endogenous small RNA-guided regulatory pathways. Virology. 376 (2), 346-356 (2008).
