Este protocolo describe un método de electroporación eficiente para la transfección de cuatro entidades organoides gastrointestinales diferentes con plásmidos más grandes (hasta una extensión de 10 kB). Se puede realizar en el plazo de un día y no necesita una preparación extensa o amortiguadores de electroporación especiales y costosos.
La electroporación es un método común para la transfección con diferentes tipos de moléculas por permeabilización eléctrica de la membrana plasmática. Con el uso cada vez mayor de organoides como método de cultivo para el material primario del paciente en los últimos años, se necesitan métodos de transferencia eficientes de componentes para la ingeniería genética en este sistema de cultivo 3D. Especialmente para los organoides, la eficiencia de las manipulaciones genéticas depende de una transfección exitosa. Así, este protocolo fue desarrollado para facilitar la electroporación de organoides y para demostrar su funcionalidad universal en diferentes entidades. Los organoides de cáncer colorrectal, pancreático, hepático y gástrico humano se electroescanearon con éxito con plásmidos pequeños y grandes en comparación. Sobre la base de los vectores de codificación GFP, la eficiencia de la transfección fue determinada por FACS. No se requiere una preparación extensiva de las células o de los amortiguadores de electroporación especiales y costosos, y el protocolo se puede realizar en el plazo de un día.
En los últimos años, se desarrolló un nuevo sistema de cultivo celular 3D, llamado organoides, para diversos tejidos normales y cancerosos. Los organoides están funcional y morfológicamente muy cerca de su tejido de origen. Se pueden generar a partir de diferentes especies, son fácilmente ampliables, genómicamente estables y genéticamente modificables, lo que los convierte en un sistema modelo ideal para las investigaciones genéticas1,2,3. Las técnicas de ingeniería genética como el sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 permiten diversas manipulaciones. La selección de clones se puede realizar mediante condiciones de medios definidas, por ejemplo, mediante la retirada de ligando WNT para APC (Adenomatosis Polyposis Coli) clones nocaut4,5. Alternativamente, los marcadores de selección tienen que ser introducidos por la reparación dirigida homóloga de un vector de segmentación6,7. Debido al hecho de que a menudo más de un plásmido necesita ser introducido, una transfección eficiente se convierte en un parámetro crucial. Además, para reducir los efectos fuera de destino inespecíficos, una expresión transitoria de la endonucleasa Cas9 es deseable8.
La electroporación es un método comparativamente simple para transfectar células con ADN, ARN, proteínas u otras macromoléculas. Por medio de pulsos eléctricos, la membrana celular se vuelve más permeable y causa un aumento de la aceptación9. En un protocolo de electroporación previamente publicado de organoides de colon se alcanzó una eficiencia del 30 % con un vector de expresión de GFP (proteína fluorescente verde) (7,4 kB) en un procedimiento de cuatro días10. El siguiente protocolo fue desarrollado para facilitar una transfección eficiente de organoides cancerosos o sanos con plásmidos grandes codificando para ARN de guía única (sgRNA) y la secuencia de endonucleasa Cas9 (por ejemplo, px458 como vector con 9,3 kb). Todo el proceso de electroporación se puede realizar en un día, sin amortiguadores especiales de electroporación, y con al menos eficiencias comparables entre diferentes organoides gastrointestinales, a saber, adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), cáncer colorrectal (CRC), colangiocarcinoma (CCC) y organoides de cáncer gástrico (GC).
Este protocolo proporciona instrucciones detalladas para una electroporación eficiente, rápida y fácil de realizar de diferentes entidades organoides. Además de los organoides tumorales presentados de PDAC, CRC, CCC y GC, funciona con éxito para organoides derivados de tejido sano también. El protocolo se puede realizar en el plazo de un día. En los protocolos de transfección organoides publicados todo el procedimiento duró cuatro días incluyendo dos días de preparaciones con diferentes tipos de medios de cultivo10,21. En nuestro protocolo no se requiere pretratamiento especial. Mediante el lavado con tampón de electroporación antes de la electroporación, se lavaron los componentes antibióticos de los medios y se logró un ajuste de las concentraciones salinas para obtener valores de impedancia óptimos. Sin embargo, algunos aspectos críticos deben ser considerados para una electroporación exitosa:
Células
En el protocolo de electroporación de Fujii et al.10 se recomienda disociar organoides a células individuales y filtrarlos a través de un colador celular de 20 m. En nuestras manos la digestión a células individuales disminuye fuertemente la supervivencia de las células. Como se sugiere en Merenda et al.21, también disociamos organoides a grupos de 10-15 células y no pudimos determinar una disminución de la eficiencia en comparación con la disociación de una sola célula. Después de la electroporación, es un paso muy importante para disociar la espuma blanca, de modo que no se pierdan células adheridas.
Para el cultivo celular 2D, se ha demostrado que un tiempo de regeneración después de la electroporación de más de 10 min hasta 40 min aumenta la supervivencia y la eficiencia de transfección especialmente de plásmidos grandes22. En los experimentos de prueba, lo mismo podría documentarse para los organoides, dando lugar a un paso de incubación de 40 minutos después de la electroporación en este protocolo. Con el fin de aumentar la recuperación de la electroporación, los cultivamos con inhibidor de la proteína quinasa asociada a Rho (ROCK) Y-27632 durante cinco a siete días23. Del mismo modo, la suplementación adicional de glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK3) inhibidor CHIR99021 está destinado a ayudar a las células individuales a recuperar10.
Configuración
Una de las ventajas del electroporator utilizado es que la impedancia se puede medir antes de la electroporación para condiciones óptimas. Según el fabricante, los valores de impedancia deben ser de 30-55o. En nuestras manos, los valores de impedancia de 30-40o han demostrado una eficiencia óptima. En un experimento preliminar, diferentes voltajes y valores de longitud de pulso del pulso de porto fueron variados para encontrar la proporción óptima de eficiencia a la supervivencia. En resumen, podríamos confirmar los valores descritos de Fujii et al.10 en las diferentes entidades descritas aquí.
Adn
El efecto de diferentes cantidades de ADN se probó en experimentos preliminares de hasta 45 g de ADN por muestra. No se pudieron detectar efectos citotóxicos. La eficiencia de transfección se incrementó de forma dependiente de la dosis con saturación > 30 g. Por lo tanto, usamos 30 g por muestra en el protocolo final, pero por supuesto se puede aumentar (por ejemplo, para la electroporación de más plásmidos en paralelo). Además, la pureza y concentración del ADN parece ser muy importante. Una concentración superior a 5 g/l ha demostrado una eficiencia óptima de transfección.
Como era de esperar, el plásmido de 9,3 kB podría ser transinfectado con una eficiencia menor que el plásmido más pequeño de 4,2 kB (ver Figura 4). Se prevé que el uso de plásmidos aún más grandes de 10 kB disminuya aún más la eficiencia. Para futuras aplicaciones, podría ser interesante probar el ADN de minicírculo como vector, ya que estos portadores de genes carecen de la columna vertebral bacteriana de un plásmido que los hace más pequeños24. Esto debería dar lugar a una mayor eficiencia de transfección. Además, para las manipulaciones basadas en CRISPR de organoides una electroporación directa de los sgRNA unidos a Cas9 como complejo de ribonucleoproteína (RNP) podría ser una alternativa o adición25.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Juliane Fohgrub, Ann-Christin Meinecke y Max Heiduk por su excelente asistencia técnica. La financiación fue proporcionada por Deutsche Krebshilfe (no 111350 y 70112925), Sander Stiftung (no 2014.104.1), Héctor Stiftung (no M65.2) y la Unión Europea (ERC no 639050).
For establishment and culture medium | |||
[Leu15] Gastrin | Sigma-Aldrich | G9145 | |
A83-01 | Tocris Bioscience | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634010 | |
B27 | Invitrogen | 17504044 | |
B27 Supplement, minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
CHIR99021 | Stemgent | 04-0004 | |
Collagenase II | Life Technologies | 17101-015 | |
Collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
Dispase II | Roche | 4942078001 | |
Dnase I | Sigma-Aldrich | D5319 | |
D-sorbitol | Roth | 6213.1 | |
Dithiothreitol | Thermo Scientific | 1859330 | |
EDTA | Roth | 8040 | |
Forskolin | Tocris Bioscience | 1099 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Hepes | Thermo Fisher Scientific | 15630106 | |
hFGF-10 | Preprotech | 100-26 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
KH2PO4 | Roth | 3904.2 | |
Matrigel | Corning | 356231 | basement matrix |
mEGF | Invitrogen | PMG8043 | |
N2 | Invitrogen | 17502048 | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
Na2HPO4 | Roth | K300.2 | |
N-Acetyl-L-Cystein | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Nicotinamid | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Noggin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (Hek293-mNoggin-Fc) |
PBS | Gibco | 14190169 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
Prostaglandin E2 | Tocris Bioscience | 2296 | |
Recombinant Human HGF | Preprotech | 100-39H | |
Rspondin | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from HEK293 cells (HA-Rspo1-Fc-293T) |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
Sucrose | VWR | 27,480,294 | |
TrypLE Express | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |
Wnt3A | n.a. | n.a. | Conditioned medium produced from L-Wnt3a cells (from Sylvia Boj) |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
Consumables | |||
Cell Strainer 100 µm | Falcon | 352360 | |
48-well plate | Corning | 3548 | |
Nepa Electroporation Cuvettes 2mm gap w/pipettes | Nepa Gene Co., Ltd. | EC-002S | |
Tubes 15 ml | Greiner | 188271 | |
Tubes 15 ml low binding | Eppendorf | 30122208 | Tubes for FACS preparing |
Equipment | |||
Electroporator Nepa21 | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
EVOS FL Auto | Invitrogen | AMAFD1000 | Fluorescence microscope |
LSRFortessa | BD Bioscience | 647800E6 | FACS |
Reagents and plasmids | |||
Live/dead fixable blue dead cell stain kit | Invitrogen | L34962 | Includes antibody for live/dead staining for FACS analysis |
EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Nutlin-3 | Selleckchem | S1061/07 | |
Opti-MEM | Gibco | 31985047 | Electroporation buffer |
2 gRNA concatemer vector | AddGene | 84879 | |
pCMV-EGFP | Nepa Gene Co., Ltd. | n.a. | |
px458 plasmid | AddGene | 48138 | coding for sgRNA and Cas9 |
px458_Conc2 plasmid | AddGene | 134449 | px458 plasmid containing 2x U6 promotors for two different sgRNAs |
sgRNA_hTP53_1a | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |
sgRNA_hTP53_1b | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |
sgRNA_hTP53_2a | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |
sgRNA_hTP53_2b | Eurofins Genomics | n.a. | ![]() |