Analisi della distribuzione tumorale e tissutale dell'anticorpo terapeutico specifico dell'antigene bersaglio
Summary
Qui presentiamo un protocollo per studiare la localizzazione in vivo degli anticorpi nei modelli di xenograft tumorale dei topi.
Abstract
Gli anticorpi monoclonali sono farmaci multifunzionali ad alta affinità che funzionano con meccanismi indipendenti variabili per eliminare le cellule tumorali. Negli ultimi decenni, il campo dei coniugati anticorpo-farmaco, degli anticorpi bispecifici, dei recettori degli antigeni chimerici (CAR) e dell’immunoterapia oncologica è emerso come l’area più promettente delle indagini di base e terapeutiche. Con numerosi studi umani di successo che prendono di mira i recettori del checkpoint immunitario e le cellule CAR-T nella leucemia e nel melanoma a un ritmo rivoluzionario, è un momento molto emozionante per le terapie oncologiche derivate dalle variazioni dell’ingegneria degli anticorpi. Purtroppo, un numero significativamente elevato di anticorpi e terapie a base di CAR si sono dimostrati deludenti anche negli studi sull’uomo di tumori solidi a causa della limitata disponibilità di cellule dell’effettore immunitario nel letto tumorale. È importante sottolineare che anche la distribuzione aspecifica di anticorpi terapeutici in tessuti diversi dai tumori contribuisce alla mancanza di efficacia clinica, tossicità associata e insufficienza clinica. Poiché la fedele traduzione di studi preclinici su percorsi clinici umani è altamente basata sull’efficacia dello xenograft tumorale dei topi e sugli studi di sicurezza, qui evidenziamo un metodo per testare il tumore e la distribuzione generale dei tessuti degli anticorpi terapeutici. Ciò si ottiene etichettando l’anticorpo purificato proteina-A con colorante fluorescente vicino all’infrarosso seguito da immagini dal vivo di topi portanti di tumore.
Introduction
La FDA approvò il primo anticorpo monoclonale che prendeva di mira CD3 (OKT3, Muromonab) nel 19861,2. Da allora per i prossimi vent’anni, c’è stata una rapida esplosione nel campo dell’ingegneria degli anticorpi a causa del travolgente successo degli anticorpi contro gli inibitori del checkpointimmunitario 3. Oltre all’attivazione indiretta del sistema immunitario, gli anticorpi sono mirati a segnalare direttamente le cellule tumorali per coinvolgere con precisione le cellule dell’effettore immunitario, innescare la citotossicità attraverso l’agonista del recettore della morte, bloccare la segnalazione di sopravvivenza delle cellule tumorali, ostruire l’angiogenesi (crescita dei vasi sanguigni), vincolare i regolatori del checkpoint immunitario, fornire radioisotopi, farmaci chemioterapici e siRNA come agenti coniugati2. Inoltre, lo studio dei frammenti variabili a catena singola (scFv) di vari anticorpi sulla superficie delle cellule T derivate dal paziente e delle cellule NK (CAR-T e CAR-NK) è un’area in rapida crescita di indagini cliniche per terapie a base cellulare4.
L’altissima affinità dei farmaci a base di anticorpi che fornisce selettività all’antigene che esprime le cellule tumorali lo rende un agente attraente. Allo stesso modo, il parto mirato e la ritenzione tumorale di un anticorpo terapeutico (o di un farmaco chimico) è la chiave per bilanciare l’efficacia rispetto alla tossicità. Pertanto, un gran numero di strategie basate sull’ingegneria proteica che includono ma non sono limitate agli anticorpibispecifici 5 e trispecifici6 vengono sfruttati per migliorare significativamente la ritenzione tumorale ottimizzata dell’avidità delle terapie iniettate per via endovenosa (IV)5,7. Qui, descriviamo un semplice metodo basato sulla fluorescenza per affrontare la distribuzione tumorale e tissutale di anticorpi anti-cancro potenzialmente efficaci.
Poiché i tessuti animali possiedono autofluorescenza quando eccitati nello spettro visibile, gli anticorpi sono stati inizialmente etichettati con colorante vicino all’infrarosso (ad esempio, IRDye 800CW). Per prove di indagini concettuali, abbiamo fatto uso di anticorpi di targeting del recettore del folato alfa-1 (FOLR1) chiamati farletuzumab e del suo derivato chiamato anticorpo Cytotoxicity di ancoraggio bispecifico (BaCa)7 che copresi bersagli FOLR1 e recettore della morte-5 (DR5)8 in un anticorpo ricombinante. FOLR1 è un recettore bersaglio sovraespresso ben definito nelle cellule tumorali ovarico e TNBC, negli xenografti tumorali e nei tumori deipazienti 9. In particolare, ci sono molteplici sforzi per sfruttare clinicamente FOLR1 utilizzando approcci basati su anticorpi per coinvolgere cellule dell’effettore immunitario e coniugati di farmaci anticorpali (ADC) per tumori ovarico emammario 10,11.
In questo documento sui metodi, abbiamo clonato, espresso e purificato l’anti-FOLR1 clinico (farletuzumab) insieme ad altri anticorpi di controllo utilizzando il sistema di espressione CHO. L’isotipo IgG1 e un anticorpo clinico anti-idiotipo mucina-16 chiamato abagovomab12 sono stati utilizzati come controlli negativi. A seguito della purificazione proteina-A, gli anticorpi indicati sono stati etichettati con IRDye 800CW e sono stati somministrati nella vena di coda di topi nudi con xenografti tumorali ovarico o FOLR1 umano stabilmente trasfetto che esprime xenografti di cancro del colon murino. La localizzazione degli anticorpi è stata monitorata mediante imaging dal vivo utilizzando spettro di imaging in vivo in più punti di tempodiversi 7. Questo metodo non richiede alcuna modifica genetica o iniezione del substrato per consentire l’emissione luminosa ed è significativamente più veloce, conveniente ed efficiente. Il protocollo generale di clonazione, espressione, purificazione ed etichettatura descritto di seguito può essere applicato a qualsiasi anticorpo clinico e non clinico se sono disponibili sequenze di catene pesanti e leggere.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’erogazione selettiva e specifica del tessuto tumorale dell’agente terapeutico anti-cancro è la chiave per misurare l’efficacia e la sicurezza di una data terapiamirata 13. Qui abbiamo descritto un approccio rapido ed efficiente per indagare la distribuzione dettagliata dei tessuti e del tumore di anticorpi BaCa clinici, farletuzumab e non clinici. L’approccio descritto è applicabile a qualsiasi anticorpo appena generato e può essere utilizzato insieme a un anticorpo clinicamente efficace (con…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati all’University of Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, alla Biomolecular Analysis Facility, all’Advanced Microscopy Facility e al Core Vivarium Facility for Assistance. J. T-S è uno dei primi investigatori in carriera della Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NCI/NIH (R01CA233752) a J. T-S, U.S. DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) premio rivoluzionario di livello 1 a J. T-S (BC17097) e U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) premio di finanziamento (OC180412) a J. T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
Referências
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