靶性抗原特异性治疗抗体的肿瘤及组织分布分析
Summary
在这里，我们提出了一个方案，研究小鼠肿瘤异种移植模型中抗体的体内定位。
Abstract
单克隆抗体是高亲和力多功能药物，通过可变的独立机制来消除癌细胞。在过去的几十年里，抗体药物结合剂、双特异性抗体、嵌合抗原受体（CAR）和癌症免疫治疗领域已成为基础和治疗研究最有希望的领域。随着无数成功的人体试验，以突破性的速度瞄准白血病和黑色素瘤中的免疫检查点受体和 CAR-T 细胞，对于抗体工程变异衍生的肿瘤治疗来说，这是非常激动人心的时刻。令人遗憾的是，由于肿瘤床中免疫效应细胞有限，大量抗体和基于 CAR 的治疗方法在实体癌症的人体试验中也被证明是令人失望的。重要的是，肿瘤以外的组织内治疗抗体的非特异性分布也导致缺乏临床疗效、相关毒性和临床失败。由于临床前研究忠实地转化为人类临床轨迹，高度依赖于小鼠肿瘤异种移植功效和安全研究，在这里我们重点介绍一种测试肿瘤和治疗抗体一般组织分布的方法。这是通过标记蛋白-A纯化抗体与近红外荧光染料，然后对肿瘤轴承小鼠进行活成像。
Introduction
FDA于1986年批准了第一个单克隆抗体靶向CD3（OKT3，Muromonab），1，2。此后的二十年里，由于抗体对免疫检查点抑制剂3的压倒性成功，抗体工程领域迅速爆炸。除了间接激活免疫系统外，抗体还旨在直接标记癌细胞，以精确接触免疫效应细胞，通过死亡受体激动剂触发细胞毒性，阻断肿瘤细胞生存信号，阻断血管生成（血管生长），约束免疫检查点调节器，提供放射性同位素，化疗药物和siRNA作为结合剂2。此外，研究患者衍生T细胞和NK细胞（CAR-T和K-NK）表面各种抗体的单链可变片段（scFv）是细胞疗法4的临床研究快速增长的领域。
抗体药物的超高亲和力，提供选择性抗原表达肿瘤细胞，使它成为一个有吸引力的剂。同样，靶向分娩和肿瘤保留治疗抗体（或化学药物）是平衡疗效与毒性的关键。因此，大量的蛋白质工程为基础的策略，包括但不限于双特异性5和三特异性抗体6正在被利用，以显著增强狂热的优化肿瘤保留静脉注射（IV）注射治疗5，7。在这里，我们描述了一个简单的荧光为基础的方法来解决肿瘤和组织分布的潜在有效的抗癌抗体。
由于动物组织在可见光谱中兴奋时具有自动荧光，因此抗体最初被标记为近红外染料（例如，IRDye 800CW）。对于概念调查的证据，我们利用叶酸受体α-1（FOLR1）靶向抗体称为法莱图祖马布及其衍生物称为双特异性锚细胞活性剂（BaCa）7抗体，共同靶对FOLR1和死亡受体-5（DR5）8在一个重组抗体。FOLR1是卵巢和TNBC癌细胞、肿瘤异种移植和患者肿瘤9中明确定义的过度表达靶向受体。值得注意的是，有多个努力，临床利用基于抗体的方法利用FOLR1，使免疫效应细胞和抗体药物结合（ADC）用于卵巢癌和乳腺癌10，11。
在本文论文中，我们使用CHO表达系统克隆、表达和纯化临床抗FOLR1（farletuzumab）以及其他对照抗体。IgG1等型和临床抗白痴粘液-16抗体称为阿巴戈沃马布12 被用作阴性对等对。在蛋白质-A纯化后，指示抗体被标记为IRDye 800CW，并施用到裸鼠的尾静脉中，要么携带卵巢肿瘤异种移植物，要么稳定地转染人类FOLR1，表达穆林结肠癌异种移植。抗体定位通过实时成像跟踪，在多个不同时间点7使用体内成像谱。这种方法不需要任何基因改造或注射基板，使光发射，并明显更快，成本效益和高效。如果有重链和轻链序列，下面描述的一般克隆、表达、纯化和标记协议可应用于任何临床和非临床抗体。
Protocol
Representative Results
Discussion
选择性和肿瘤组织特异性传递抗癌治疗剂是衡量特定靶向治疗疗效和安全性的关键。在这里，我们描述了一个快速和有效的方法，以调查临床，farletuzumab和非临床BaCa抗体的详细组织和肿瘤分布。所述方法适用于任何新生成的抗体，可与临床有效抗体（具有所需质量）一起用于其肿瘤/器官分布特性。考虑到大多数抗体靶点受体（如乳腺癌中的 HER2）在肿瘤细胞（组织）中表达过度…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢弗吉尼亚大学癌症中心核心成像设施、生物分子分析设施、高级显微镜设施和核心维瓦里姆援助设施。J. T-S 是卵巢癌学院 （OCA-DoD） 的早期职业调查员。这项工作得到了NCI/NIH赠款（R01CA233752）对J.T-S，美国DD乳腺癌研究计划（BCRP）突破1级奖J.T-S（BC17097）和美国多德卵巢研究计划（OCRP）资助奖（OC180412）J.T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
Referências
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
