Analyse van tumor- en weefselverdeling van doelantigeen-specifiek therapeutisch antilichaam
Summary
Hier presenteren we een protocol om de in vivo lokalisatie van antilichamen in muizen tumor xenograft modellen te bestuderen.
Abstract
Monoklonale antilichamen zijn hoge affiniteit multifunctionele geneesmiddelen die werken door variabele onafhankelijke mechanismen om kankercellen te elimineren. In de afgelopen decennia is het gebied van antilichaam-drug conjugaten, bispecifieke antilichamen, chimerische antigeenreceptoren (CAR) en kankerimmunotherapie naar voren gekomen als het meest veelbelovende gebied van basis- en therapeutische onderzoeken. Met tal van succesvolle menselijke proeven gericht op immuun checkpoint receptoren en CAR-T cellen in leukemie en melanoom in een doorbraak tempo, het is zeer spannende tijden voor oncologische therapieën afgeleid van variaties van antilichaam engineering. Helaas, een aanzienlijk groot aantal antilichamen en CAR gebaseerde therapieën hebben ook bewezen teleurstellend in menselijke proeven van vaste kankers vanwege de beperkte beschikbaarheid van immuun-effector cellen in de tumor bed. Belangrijk is dat niet-specifieke distributie van therapeutische antilichamen in andere weefsels dan tumoren ook bijdraagt aan het gebrek aan klinische werkzaamheid, bijbehorende toxiciteit en klinisch falen. Zoals getrouwe vertaling van preklinische studies in menselijke klinische paden zijn sterk vertrouwd op muizen tumor xenograft werkzaamheid en veiligheid studies, hier wijzen we op een methode om de tumor en de algemene weefseldistributie van therapeutische antilichamen te testen. Dit wordt bereikt door het etiketteren van de eiwit-Een gezuiverd antilichaam met in de buurt infrarood fluorescerende kleurstof gevolgd door live beeldvorming van tumordragende muizen.
Introduction
FDA keurde het eerste monoklonale antilichaam dat CD3 (OKT3, Muromonab) richt in 1986goed 1,2. Sindsdien voor de komende twintig jaar, is er een snelle explosie op het gebied van antilichaam engineering als gevolg van het overweldigende succes van antilichamen tegen immuun checkpoint remmers3. Naast indirecte activering van het immuunsysteem, antilichamen worden gericht op het direct markeren van kankercellen om precies te betrekken immuun effector cellen, trigger cytotoxiciteit via death receptor agonist, blokkeren tumorcel overleving signalering, obstructie van angiogenese (groei van bloedvaten), beperken immuun regulator checkpoints, leveren radio-isotopen, chemotherapie drugs en siRNA als een geconjugeerde middelen2. Daarnaast is het bestuderen van de variabele fragmenten van de enkele keten (scFv) van verschillende antilichamen op het oppervlak van door de patiënt afgeleide T-cellen en NK-cellen (CAR-T en CAR-NK) een snel groeiend gebied van klinische onderzoeken voor celgebaseerde therapieën4.
De ultrahoge affiniteit van op antilichamen gebaseerde geneesmiddelen die selectiviteit biedt aan antigeenexpressie tumorcellen maakt het een aantrekkelijk middel. Ook de gerichte levering en tumorretentie van een therapeutisch antilichaam (of een chemisch medicijn) is de sleutel tot evenwicht werkzaamheid over toxiciteit. Daarom wordt een groot aantal op eiwitengineering gebaseerde strategieën uitgebuit die geen bispecifieke5- en tri-specifieke antilichamen6 bevatten, om de avidity optimized tumorretentie van intraveneus (IV) geïnjecteerde therapieën5,7aanzienlijk te verbeteren . Hier beschrijven we een eenvoudige fluorescentie gebaseerde methode om de tumor- en weefselverdeling van potentieel effectieve anti-kankerantilichamen aan te pakken.
Omdat dierlijke weefsels autofluorescentie bezitten wanneer ze opgewonden zijn in zichtbaar spectrum, werden de antilichamen aanvankelijk gelabeld met nabij Infrarood kleurstof (bijvoorbeeld IRDye 800CW). Voor proofs of concept investigations, hebben we gebruik gemaakt van foliumzuur receptor alpha-1 (FOLR1) gericht op antilichaam genaamd farletuzumab en de afgeleide genaamd Bispecifieke anker Cytotoxiciteit activator (BaCa)7 antilichaam dat co-doelen FOLR1 en death receptor-5 (DR5)8 in een recombinant antilichaam. FOLR1 is een goed gedefinieerde overexpressed doelreceptor in eierstokkanker- en TNBC-kankercellen, tumor xenografts en patiënttumoren9. Met name zijn er meerdere inspanningen om folr1 klinisch te exploiteren met behulp van op antilichamen gebaseerde benaderingen om immuuneffectorcellen en antilichaammedicatie (ADC) in te schakelen voor eierstokkanker en borstkanker10,11.
In deze methoden papier, we gekloond, uitgedrukt en gezuiverd klinische anti-FOLR1 (farletuzumab) samen met andere controle antilichamen met behulp van CHO expressie systeem. IgG1 isotype en een klinische anti-idiotype mucin-16 antilichaam genaamd abagovomab12 werden gebruikt als negatieve controles. Na eiwit-A zuivering, geïndiceerde antilichamen werden gelabeld met IRDye 800CW en werden toegediend in de staart ader van naakte muizen ofwel met eierstokkanker xenografts of stabiel getransfecteerd menselijke FOLR1 uitdrukken murine dikke darmkanker xenografts. De lokalisatie van antilichamen werd gevolgd door live beeldvorming met behulp van in vivo beeldspectrum op meerdere verschillende tijdstippen7. Deze methode vereist geen genetische modificatie of injectie van het substraat om lichtemissie mogelijk te maken en is aanzienlijk sneller, kosteneffectief en efficiënt. Het hieronder beschreven algemene kloon-, expressie-, zuiverings- en etiketteringsprotocol kan worden toegepast op elk klinisch en niet-klinisch antilichaam als er zware en lichte kettingsequenties beschikbaar zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selectieve en tumorweefsel specifieke levering van anti-kanker therapeutisch middel is de sleutel tot het meten van de werkzaamheid en veiligheid van een bepaalde gerichte therapie13. Hier hebben we een snelle en efficiënte aanpak beschreven om de gedetailleerde weefsel- en tumordistributie van klinische, farletuzumab en een niet-klinisch BaCa-antilichaam te onderzoeken. De beschreven aanpak is van toepassing op elk nieuw gegenereerd antilichaam en kan worden gebruikt naast een klinisch effectief…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn de Universiteit van Virginia Cancer Center Core Imaging Facility, Biomoleculaire Analyse Faciliteit, Advanced Microscopy Facility en de Core Vivarium Facility for Assistance dankbaar. J. T-S is een vroege carrière onderzoeker van Ovarian Cancer Academy (OCA-DoD). Dit werk werd ondersteund door NCI / NIH subsidie (R01CA233752) aan J. T-S, US DoD Breast Cancer Research Program (BCRP) doorbraak level-1 award aan J. T-S (BC17097) en U.S. DoD Ovarian Cancer Research Program (OCRP) financiering award (OC180412) aan J. T-S
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
Referências
- Takahashi, K. Muromonab CD3 (Orthoclone OKT3). Journal of Toxicological Sciences. 20, 483-484 (1995).
- Tushir-Singh, J. Antibody-siRNA conjugates: drugging the undruggable for anti-leukemic therapy. Expert Opinion in Biological Therapy. 17, 325-338 (2017).
- Gravitz, L. Cancer immunotherapy. Nature. 504, 1 (2013).
- Pagel, J. M., West, H. J. Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-Cell Therapy. JAMA Oncology. 3, 1595 (2017).
- Brinkmann, U., Kontermann, R. E. The making of bispecific antibodies. MAbs. 9, 182-212 (2017).
- Runcie, K., Budman, D. R., John, V., Seetharamu, N. Bi-specific and tri-specific antibodies- the next big thing in solid tumor therapeutics. Molecular Medicine. 24, 50 (2018).
- Shivange, G., et al. A Single-Agent Dual-Specificity Targeting of FOLR1 and DR5 as an Effective Strategy for Ovarian Cancer. Cancer Cell. 34, 331-345 (2018).
- Wajant, H. Molecular Mode of Action of TRAIL Receptor Agonists-Common Principles and Their Translational Exploitation. Cancers (Basel). 11 (7), 954 (2019).
- Necela, B. M., et al. Folate receptor-alpha (FOLR1) expression and function in triple negative tumors. PLoS One. 10, 0122209 (2015).
- Lin, J., et al. The antitumor activity of the human FOLR1-specific monoclonal antibody, farletuzumab, in an ovarian cancer mouse model is mediated by antibody-dependent cellular cytotoxicity. Cancer Biology Therapy. 14, 1032-1038 (2013).
- Chen, Y., Kim, M. T., Zheng, L., Deperalta, G., Jacobson, F. Structural Characterization of Cross-Linked Species in Trastuzumab Emtansine (Kadcyla). Bioconjugate Chemistry. 27, 2037-2047 (2016).
- Bauerschlag, D. O., et al. Anti-idiotypic antibody abagovomab in advanced ovarian cancer. Future Oncology. 4, 769-773 (2008).
- Narita, Y., Muro, K. Challenges in molecular targeted therapy for gastric cancer: considerations for efficacy and safety. Expert Opinion in Drug Safety. 16, 319-327 (2017).
- Jordan, N. V., et al. HER2 expression identifies dynamic functional states within circulating breast cancer cells. Nature. 537, 102-106 (2016).
- Fakih, M., Vincent, M. Adverse events associated with anti-EGFR therapies for the treatment of metastatic colorectal cancer. Current Oncology. 17, 18-30 (2010).
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. American Journal of Pathology. 182, 319-324 (2013).
- van der Wall, E. E. Cost analysis favours SPECT over PET and CTA for evaluation of coronary artery disease: the SPARC study. Netherland Heart Journal. 22, 257-258 (2014).
- Van Dort, M. E., Rehemtulla, A., Ross, B. D. PET and SPECT Imaging of Tumor Biology: New Approaches towards Oncology Drug Discovery and Development. Current Computer Aided Drug Design. 4, 46-53 (2008).
- Dua, P., Hawkins, E., van der Graaf, P. H. A Tutorial on Target-Mediated Drug Disposition (TMDD) Models. CPT Pharmacometrics and System Pharmacology. 4, 324-337 (2015).
