लक्ष्य एंटीजन विशिष्ट चिकित्सीय एंटीबॉडी के ट्यूमर और ऊतक वितरण का विश्लेषण
Summary
यहां हम चूहों ट्यूमर xenograft मॉडल में एंटीबॉडी के वीवो स्थानीयकरण में अध्ययन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं।
Abstract
मोनोक्लोनल एंटीबॉडी उच्च एफ़िनिटी मल्टीफंक्शनल दवाएं हैं जो कैंसर कोशिकाओं को खत्म करने के लिए चर स्वतंत्र तंत्र द्वारा काम करती हैं। पिछले कुछ दशकों में एंटीबॉडी-ड्रग कंजूगेट्स, बिस्पीफिक एंटीबॉडी, चिमरिक एंटीजन रिसेप्टर्स (सीएआर) और कैंसर इम्यूनोथेरेपी का क्षेत्र बुनियादी और चिकित्सीय जांच के सबसे आशाजनक क्षेत्र के रूप में उभरा है । एक सफलता की गति से ल्यूकेमिया और मेलानोमा में प्रतिरक्षा चेकपॉइंट रिसेप्टर्स और कार-टी कोशिकाओं को लक्षित करने वाले कई सफल मानव परीक्षणों के साथ, यह एंटीबॉडी इंजीनियरिंग की विविधताओं से प्राप्त ऑन्कोलॉजिक चिकित्सा के लिए बेहद रोमांचक समय है। अफसोस, एंटीबॉडी और कार आधारित चिकित्सा विज्ञान की एक काफी बड़ी संख्या में भी ट्यूमर बिस्तर में प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं की सीमित उपलब्धता की वजह से ठोस कैंसर के मानव परीक्षणों में निराशाजनक साबित कर दिया है । महत्वपूर्ण बात, ट्यूमर के अलावा ऊतकों में चिकित्सीय एंटीबॉडी का गैर-विशिष्ट वितरण भी नैदानिक प्रभावकारिता, संबद्ध विषाक्तता और नैदानिक विफलता की कमी में योगदान देता है। मानव नैदानिक ट्रेल्स में प्रीक्लिनिकल अध्ययनों के वफादार अनुवाद के रूप में चूहों ट्यूमर ज़ेनोग्राफ़ प्रभावकारिता और सुरक्षा अध्ययनों पर अत्यधिक भरोसा किया जाता है, यहां हम चिकित्सकीय एंटीबॉडी के ट्यूमर और सामान्य ऊतक वितरण का परीक्षण करने के लिए एक विधि पर प्रकाश डालते हैं। यह प्रोटीन-एक शुद्ध एंटीबॉडी के पास अवरक्त फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबलिंग द्वारा प्राप्त किया जाता है जिसके बाद ट्यूमर असर चूहों की लाइव इमेजिंग होती है।
Introduction
एफडीए ने 19861,2में सीडी 3 (ओकेटी3, मुरोमोनाब) को लक्षित करने वाले पहले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को मंजूरी दी। तब से अगले बीस वर्षों के लिए, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट अवरोधकों के खिलाफ एंटीबॉडी की भारी सफलता के कारण एंटीबॉडी इंजीनियरिंग के क्षेत्र में तेजी से विस्फोट हुआ है3। प्रतिरक्षा प्रणाली के अप्रत्यक्ष सक्रियण के अलावा, एंटीबॉडी को सीधे प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं को शामिल करने के लिए कैंसर कोशिकाओं को ध्वजांकित करने, डेथ रिसेप्टर एगोनिस्ट के माध्यम से साइटोटॉक्सिक्सिटी को ट्रिगर करने, ट्यूमर सेल सर्वाइवल सिग्नलिंग को ब्लॉक करने, एंजियोजेनेसिस (रक्त वाहिकाओं के विकास) में बाधा डालने, प्रतिरक्षा चेकपॉइंट नियामकों को बाधित करने, रेडियोआइसोटोप, कीमोथेरेपी दवाओं और सिआरएनए को एक समझौताएजेंटों केरूप में वितरित करने का लक्ष्य रखा जा रहा है। इसके अलावा, रोगी व्युत्पन्न टी-कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं (कार-टी और कार-एनके) की सतह पर विभिन्न एंटीबॉडी के एकल श्रृंखला चर टुकड़ों (एससीएफवी) का अध्ययन करना सेल-आधारित उपचार4के लिए नैदानिक जांच का एक तेजी से बढ़ता क्षेत्र है।
एंटीबॉडी आधारित दवाओं की अल्ट्रा-हाई एफ़िनिटी जो एंटीजन को ट्यूमर कोशिकाओं को व्यक्त करने के लिए चयनशीलता प्रदान करती है, यह एक आकर्षक एजेंट बनाती है। इसी तरह, लक्षित वितरण और एक चिकित्सीय एंटीबॉडी (या एक रासायनिक दवा) के ट्यूमर प्रतिधारण विषाक्तता पर प्रभावकारिता संतुलन की कुंजी है । इसलिए, बड़ी संख्या में प्रोटीन इंजीनियरिंग आधारित रणनीतियां शामिल हैं, जिनमें बिस्पिफिक5 और त्रि-विशिष्ट एंटीबॉडी6 तक सीमित नहीं हैं, नसों के अनुकूलित ट्यूमर प्रतिधारण को बढ़ाने के लिए शोषण किया जा रहा है (IV) इंजेक्शन थे चिकित्सीय5,7। यहां, हम संभावित प्रभावी कैंसर विरोधी एंटीबॉडी के ट्यूमर और ऊतक वितरण को संबोधित करने के लिए एक साधारण फ्लोरेसेंस-आधारित विधि का वर्णन करते हैं।
क्योंकि पशु ऊतकों के पास ऑटो-फ्लोरेसेंस होता है जब दृश्यमान स्पेक्ट्रम में उत्साहित होता है, एंटीबॉडी को शुरू में निकट इन्फ्रारेड डाई (जैसे, IRDye 800CW) के साथ लेबल किया गया था। अवधारणा जांच के सबूत के लिए, हम फोलेट रिसेप्टर अल्फा-1 (FOLR1) का उपयोग किया है fletuzumab कहा जाता है औरइसके व्युत्पन्न बिस्पेशिक एंकर Cytotoxicity सक्रियक (BaCa) 7 एंटीबॉडी कहा जाता है कि सह लक्ष्य FOLR1 और मौत रिसेप्टर-5 (DR5)8 एक recombinant एंटीबॉडी में । FOLR1 ओवेरियन और टीएनबीसी कैंसर कोशिकाओं, ट्यूमर xenografts और रोगी ट्यूमर 9 में एक अच्छीतरहसे परिभाषित अतिव्यक्त लक्ष्य रिसेप्टर है । विशेष रूप से, ओवेरियन और स्तन कैंसर10,11के लिए प्रतिरक्षा प्रभावक कोशिकाओं और एंटीबॉडी दवा conjugates (एडीसी) को शामिल करने के लिए एंटीबॉडी आधारित दृष्टिकोणों का उपयोग करके FOLR1 का चिकित्सकीय रूप से दोहन करने के लिए कई प्रयासहैं।
इस तरीके के कागज में, हमने चो अभिव्यक्ति प्रणाली का उपयोग करके अन्य नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ नैदानिक एंटी-एफओएलआर1 (फारलेजुमाब) का क्लोन, व्यक्त और शुद्ध किया। IgG1 आइसोटाइप और एक नैदानिक विरोधी मूर्खता मसिन-16 एंटीबॉडी abagovomab12 कहा जाता है नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया । प्रोटीन-ए शुद्धिकरण के बाद, संकेत दिया कि एंटीबॉडी को IRDye 800CW के साथ लेबल किया गया था और नग्न चूहों की पूंछ नस में प्रशासित किया गया था या तो ओवेरियन ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट्स असर या छुरा संक्रमित मानव FOLR1 murine पेट के कैंसर xenografts व्यक्त करते हैं । एंटीबॉडी लोकलाइजेशन को लाइव इमेजिंग द्वारा वीवो इमेजिंग स्पेक्ट्रम में कई अलग – अलग समयबिंदुओं पर उपयोगकरके ट्रैक किया गया था। इस विधि को प्रकाश उत्सर्जन को सक्षम करने के लिए सब्सट्रेट के किसी आनुवंशिक संशोधन या इंजेक्शन की आवश्यकता नहीं होती है और यह काफी तेज, लागत प्रभावी और कुशल है। नीचे वर्णित सामान्य क्लोनिंग, अभिव्यक्ति, शुद्धिकरण और लेबलिंग प्रोटोकॉल को किसी भी नैदानिक और गैर-नैदानिक एंटीबॉडी पर लागू किया जा सकता है यदि भारी और प्रकाश श्रृंखला दृश्य उपलब्ध हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
कैंसर रोधी चिकित्सीय एजेंट की चयनात्मक और ट्यूमर ऊतक विशिष्ट डिलीवरी किसी दिए गए लक्षित चिकित्सा13की प्रभावकारिता और सुरक्षा को मापने की कुंजी है । यहां हमने नैदानिक, फर्लेदुम्ब और एक गैर-नै?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वर्जीनिया कैंसर सेंटर कोर इमेजिंग सुविधा, बायोमॉलिक्यूलर विश्लेषण सुविधा, उन्नत माइक्रोस्कोपी सुविधा और सहायता के लिए कोर विवरियम सुविधा विश्वविद्यालय के आभारी हैं। जे टी-एस ओवेरियन कैंसर अकादमी (ओसीए-डीओडी) के शुरुआती करियर अन्वेषक हैं । इस काम को एनसीआई/एनआईएच ग्रांट (R01CA233752) ने जे टी-एस, यूएस डीओडी ब्रेस्ट कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (बीसीआरपी) सफलता स्तर-1 पुरस्कार जे टी-एस (BC17097) और अमेरिकी डीओडी ओवेरियन कैंसर रिसर्च प्रोग्राम (OCRP) फंडिंग अवार्ड (OC180412) को जे-एस को समर्थन दिया ।
Materials
| FreeStyle CHO media | Gibco Life Technologies | Cat # 12651-014 | |
| Anti-Anti (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 15240-062 | |
| Anti-Clumping Agent | Gibco Life Technologies | Cat # 01-0057DG | |
| BD Insulin Syringe | BD BioSciences | Cat #329420 | |
| Caliper IVIS Spectrum | PerkinElmer | Cat #124262 | |
| CHO CD EfficientFeed B | Gibco Life Technologies | Cat #A10240-01 | |
| Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) | Corning | Cat # 10-13-CV | |
| Corning 500 mL RPMI 1640 | Corning | Cat # 10-040-CV | |
| Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | Cat # 709-175-149 | |
| GlutaMax-I (100X) | Gibco Life Technologies | Cat # 35050-061 | |
| HiPure Plasmid Maxiprep kit | Invitrogen | Cat # K21007 | |
| HiTrap MabSelect SuRe Column | GE Healthcare | Cat # 11-0034-93 | |
| Infusion | Takara BioScience | STO344 | |
| IRDye 800CW NHS Ester | LI-COR | Cat # 929-70020 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | Cat # 11695-6777-2 | |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh Lacri-Lube | Cat #4089 | |
| Matrigel | Corning | Cat # 354234 | |
| PEI transfection reagent | Thermo Fisher | Cat # BMS1003A | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes | Thermo Scientific | Cat # 66333 | |
| Steritop Vacuum Filters | Millipore Express | Cat #S2GPT02RE | |
| Trypsin-EDTA | Gibco Life Technologies | Cat # 15400-054 | |
| Experimental Models: Cell lines | |||
| Human: OVCAR-3 | American Type Culture Collection | ATCC HTB-161 | |
| Human: CHO-K cells | Stable transformed in our lab | ATCC CCL-61 | |
| Mouse: 4T1 | Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA | ||
| Mouse: MC38 | Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC | Authenticated by STR profiling | |
| Mouse: MC38 hFOLR1 | Generated in our laboratory (This paper) | ||
| Experimental Models: Animal | |||
| Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ | Envigo | Multiple Orders | |
| Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | Jackson Laboratory | Multiple Orders |
Referências
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