ブライトフィールド顕微鏡を用いた幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズの定量化
Summary
ここでは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズを定量化する方法を実証し、肝臓の成長と発達に対する遺伝的および薬理学的操作の効果を評価する方法を提供する。
Abstract
肝細胞癌(HCC)のいくつかのトランスジェニックゼブラフィッシュモデルでは、肝腫は幼虫初期段階で観察することができる。ゼブラフィッシュHCCモデルにおける幼虫の肝臓のサイズを定量化することは、腫瘍遺伝子関連の表現型に対する薬物および他の操作の影響を迅速に評価する手段を提供する。ここでは、ゼブラフィッシュの幼虫を固定し、肝臓を取り巻く組織を解剖し、明視野顕微鏡を用いて肝臓を撮影し、肝臓面積を測定し、結果を分析する方法を示します。このプロトコルは、肝臓のサイズの迅速かつ正確な定量化を可能にします。この方法は、肝領域を測定することを含む, それは肝臓の体積の違いを過小評価可能性があります, そして、補完的な方法論は、細胞のサイズの変化と細胞数の変化を区別するために必要とされます.本明細書に記載される解剖技術は、免疫蛍光染色およびin situハイブリダイゼーションを含む無数の下流アプリケーションのための自然な位置で肝臓、腸、膵臓を視覚化するための優れたツールです。幼虫の肝臓のサイズを定量化するための説明された戦略は、肝臓の発達と再生の多くの側面に適用可能です。
Introduction
肝細胞癌(HCC)は、肝臓1の最も一般的な原発性悪性腫瘍であり、癌関連死亡率2の第3の主要な原因である。肝癌のメカニズムを理解し、潜在的なHCC治療薬を同定するために、我々および他の人々は、β-カテニン3、4、Kras(V12)5、6、Myc7、またはYap18のような腫瘍遺伝子の肝細胞特異的発現が成人動物のHCCにつながるトランスジェニックゼブラフィッシュを開発しました。これらのゼブラフィッシュでは、肝臓の拡大は受精後6日(dpf)に早くも注目され、腫瘍遺伝子駆動の肝臓過剰増殖に対する薬物および遺伝的変化の効果をテストするためのファシリティプラットフォームを提供する。幼虫の肝臓のサイズの正確かつ正確な測定は、これらの操作の効果を決定するために不可欠です。
肝臓の大きさと形状は、CY3-SA標識9または肝細胞特異的蛍光レポーターおよび蛍光分光顕微鏡顕微鏡法を用いた生きたゼブラフィッシュ幼虫で固定ゼブラフィッシュ幼虫で半定量的に評価することができる5,6。後者の方法は比較的速く、その精度の欠如は、画像処理ソフトウェア7、10を使用して各肝臓の面積を撮影して測定することによって対処することができる。しかし、2次元の肝臓領域が肝臓の大きさを正確に表すような実験で、すべての生きた幼虫を均一に配置することは技術的に困難である可能性があります。肝臓のサイズを定量する同様の技術は、幼虫肝容積8を定量するために光シート蛍光顕微鏡を使用することを含むが、これは肝臓が異なる次元で不均一に拡大された場合のサイズの違いを検出するためのより正確であるかもしれない。蛍光活性化細胞選別(FACS)は、幼虫肝臓における蛍光標識肝細胞および他の肝細胞タイプの数を数えるために使用することができる8、11。この方法では、幼虫の肝臓がプールされ、解き分け、個々の肝臓のサイズと形状に関する情報が失われます。他の肝サイズ決定方法と組み合わせて、FACSは増加した細胞数(過形成)と増加した細胞サイズ(肥大)との間の分化を可能にする。これらの方法はすべて高価な蛍光技術(顕微鏡または細胞選別器)を採用し、CY3-SA標識を除いて、蛍光レポーターによる肝細胞の標識を必要とする。
ここでは、明視野顕微鏡および画像処理ソフトウェア3、12、13、14を用いてゼブラフィッシュ幼虫の肝臓領域を定量する方法について詳細に説明する。このプロトコルは、蛍光顕微鏡を使用せずに、その場で個々の肝臓の面積を正確に定量化することができます。肝臓のサイズを分析しながら、我々は、研究者の偏見を低減し、科学的な厳しさを向上させるために画像のアイデンティティを盲目に15.
Protocol
Representative Results
Discussion
肝臓の発達、再生、および腫瘍形成を理解することを目的とした研究では、肝臓のサイズの定量化は重要です。ここで説明するプロトコルは、幼虫ゼブラフィッシュの肝臓サイズ定量のための比較的迅速かつ簡単で安価な技術です。プロトコルの特定の側面を実行しながら適切な注意を払うことは、結果の精度を高め、フラストレーションを減らすことに役立ちます。
?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ユタ大学のマリン・ホッブスと中央集権ゼブラフィッシュ動物資源(CZAR)が、この研究の一部を行うためのゼブラフィッシュの畜産、実験室スペース、および機器を提供することを認めたい。CZARの拡張は、NIH助成金#1G20OD018369-01によって部分的にサポートされています。また、ロドニー・スチュワート、クロエ・リム、ランス・グラハム、コーディ・ジェームズ、ギャレット・ニックム、ハンツマンがん研究所(HCI)ゼブラフィッシュ・ファシリティに感謝したいと思います。R プログラミングの支援を受けてくださったケネス・コンパスに感謝します。この研究は、ハンツマンがん財団(ハンツマンがん研究所に授与された助成金P30 CA042014)(KJE)とNIH / NCI R01CA222570(KJE)からの助成金の一部によって資金提供されました。
Materials
| Camera for dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Dissecting microscope | Leica, for example | ||
| Fine (Dumont #5) forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Glass pipets | VWR | 14672-608 | |
| Image analysis software | Image J/FIJI | ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: https://imagej.net/Welcome | |
| Methyl cellulose | Sigma | M0387 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phosphate-buffered saline | Various suppliers | ||
| Pipette pump | VWR | 53502-233 | |
| Plastic Petri dishes | USA Scientific Inc | 2906 | |
| Pyrex 9-well round-bottom glass dish | VWR | 89090-482 | |
| Software for blinding files | R project | R can be downloaded for free: https://www.r-project.org/ | |
| Scientific graphing and statistics software | GraphPad Prism | ||
| Spreadsheet program | Microsoft Excel | ||
| Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S) | Western Chemical | 200-226 | |
| Very fine (Dumont #55) forceps | Fine Science Tools | 11255-20 |
Referências
- Lin, D. -. C., et al. Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma. Pesquisa do Câncer. 77 (9), 2255-2265 (2017).
- Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis. Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).
- Evason, K. J., et al. Identification of Chemical Inhibitors of β-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish. PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).
- Kalasekar, S. M., et al. Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish. Biology Open. 8 (10), (2019).
- Nguyen, A. T., et al. A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish. Disease Models & Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).
- Nguyen, A. T., et al. An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).
- Li, Z., et al. A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors. Disease Models & Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).
- Cox, A. G., et al. Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth. Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes. Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).
- Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish. Pesquisa do Câncer. 77 (6), 1395-1407 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).
- Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
- Dai, W., et al. High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs. Nutrition & Metabolism. 12, 42 (2015).
- Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Disease Models & Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).
- Delous, M., et al. Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development. PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).
- Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. Restriction of hepatic competence by Fgf signaling. Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
