Udvikling af en Larval Zebrafish Infektion Model for Clostridioides difficile
Summary
Præsenteret her er en sikker og effektiv metode til at inficere zebrafisk larver med fluorescerende mærket anaerobe C. difficile ved mikroinjektion og noninvasive microgavage.
Abstract
Clostridioides difficile infektion (CDI) anses for at være en af de mest almindelige sundheds-relaterede gastrointestinale infektioner i USA. Den medfødte immunrespons mod C. difficile er blevet beskrevet, men de nøjagtige roller neutrofiler og makrofager i CDI er mindre forstået. I den nuværende undersøgelse, Danio rerio (zebrafisk) larver bruges til at etablere en C. difficile infektion model for billeddannelse adfærd og samarbejde af disse medfødte immunceller in vivo. For at overvåge C. difficileer der etableret en mærkningsprotokol ved hjælp af et fluorescerende farvestof. En lokaliseret infektion opnås ved microinjecting mærket C. difficile, som aktivt vokser i zebrafisk tarmkanalen og efterligner tarmepitel skader i CDI. Men, denne direkte infektion protokol er invasiv og forårsager mikroskopiske sår, som kan påvirke eksperimentelle resultater. Derfor er en mere noninvasive mikrogavage protokol er beskrevet her. Metoden indebærer levering af C. difficile celler direkte ind i tarmen af zebrafisk larver ved intubation gennem den åbne mund. Denne infektion metode nøje efterligner den naturlige infektion rute C. difficile.
Introduction
C. difficile er en gram-positiv, spore-dannende, anaerobe, og toksin-producerende bacillus, der er den hyppigste årsag til alvorlige infektioner i mave-tarmkanalen1. Typiske symptomer på CDI omfatter diarré, mavesmerter, og fatale pseudomembranøs colitis, og det kan undertiden føre til døden1,2. Dokumentation har vist, at værtsimmunrespons spiller en afgørende rolle i både progression og udfald af denne sygdom3. Ud over immunrespons, den indfødte tarm mikrobiota er afgørende for debut og patogenese af CDI4. I det seneste årti er både antallet af tilfælde og dødeligheden af CIU steget betydeligt på grund af fremkomsten af en hypervirulent stamme af C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. En bedre forståelse af underliggende immunmekanismer og mikrobiotaens rolle under CDI vil bidrage til at føre til nye terapeutiske udviklinger og fremskridt, hvilket muliggør bedre kontrol med denne epidemi.
Flere dyremodeller, såsom hamster og mus, er blevet udviklet til at give indsigt i immunforsvaret mod C. difficile7,8. Men, rollen som medfødte immunceller er stadig dårligt forstået, især da medfødte immuncelle adfærd er hovedsageligt stammer fra histologisk analyse eller dyrkede celler in vitro. Derfor vil etablering af en gennemsigtig zebrafisk model til at afsløre den medfødte immunrespons på C. difficile inde i en levende hvirveldyr organisme vil lette sådanne undersøgelser. Zebrafisk larver har en funktionel medfødte immunsystem, men de mangler adaptive immunsystem indtil 4-6 uger efter befrugtning9. Denne unikke funktion gør zebrafisk larver en fremragende model til at studere den isolerede respons og funktion af medfødte immunceller i CDI.
Denne rapport beskriver nye metoder ved hjælp af zebrafisk larver til at studere samspillet mellem C. difficile og medfødte immunceller, såsom makrofager og neutrofiler. For det første præsenteres en lokaliseret mikroinjektionsprotokol, der omfatter C. difficile inoculum og farvning. Ved hjælp af in vivo confocal time-lapse imaging, er reaktionen af neutrofiler og makrofager mod infektionsstedet registreres, og fagocytose af bakterier af neutrofiler og makrofager er observeret. Men, Det er blevet rapporteret, at injektionen selv forårsager vævsskader og fører til rekruttering af leukocytter uafhængig afbakterierne 10. Derfor beskrives en noninvasive mikrogavageprotokol til at levere C. difficile ind i tarmen af zebrafisklarver efterfølgende beskrevet. Tidligere undersøgelser har vist, at indfødte gastrointestinale mikrobiota beskytte en vært mod kolonisering af C. difficile11. Derfor er gnotobiotiske zebrafisk larver også bruges til at disponere zebrafisk, der er inficeret 12. Derefter udføres tarmdissektion for at genvinde levedygtige C. difficile og validere varigheden af deres tilstedeværelse i zebrafisk tarmkanalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fremlagte metoder ændrer og udvider en eksisterende tilgang til at inficere zebrafisklarver ved at udføre både injektion og mikrogavage10,14. Det viser også en tilgang til at studere anaerobe patogener med zebrafisk larver22. Desuden letter protokollen analysen af medfødte immuncellereaktioner in vivo på CDI og ved kolonisering af C. difficile i zebrafisk. Metoden er reproducerbar og nem at udføre i et rutinemæssigt lab…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for Timo Fritsch for fremragende dyrepleje. Vi takker medlemmerne af Köster og Steinert labs for støtte og nyttige diskussioner. Vi takker dr. Dandan Han for kritisk læsning af manuskriptet. Vi anerkender taknemmeligt finansieringen fra forbundsstaten Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
Referências
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
