Sviluppo di un modello di infezione del pesce zebra Larval per Clostridioides difficile
Summary
Presentato qui è un metodo sicuro ed efficace per infettare le larve di pesce zebra con C. difficile anaerobica etichettato fluorescentmente per microiniezione e microgavage non invasivo.
Abstract
Clostridioides difficile infezione (CDI) è considerato una delle infezioni gastrointestinali più comuni associate all’assistenza sanitaria negli Stati Uniti. È stata descritta la risposta immunitaria innata contro C. difficile, ma i ruoli esatti dei neutrofili e dei macrofagi nel CDI sono meno compresi. Nello studio attuale, le larve di Danio rerio (pesce zebra) vengono utilizzate per stabilire un modello di infezione da C. difficile per l’imaging del comportamento e della cooperazione di queste cellule immunitarie innate in vivo. Per monitorare C. difficile, è stato stabilito un protocollo di etichettatura utilizzando un tintura fluorescente. Un’infezione localizzata è ottenuta microiniettando etichettato C. difficile, che cresce attivamente nel tratto intestinale del pesce zebra e imita il danno epiteliale intestinale in CDI. Tuttavia, questo protocollo di infezione diretta è invasivo e provoca ferite microscopiche, che possono influenzare i risultati sperimentali. Di conseguenza, un protocollo di microgavazione più non invasivo è descritto qui. Il metodo prevede la consegna di cellule C. difficile direttamente nell’intestino delle larve di pesce zebra per intubazione attraverso la bocca aperta. Questo metodo di infezione imita da vicino il percorso di infezione naturale di C. difficile.
Introduction
C. difficile è un bacillo gram-positivo, spore-forming, anaerobico, e tossina che produce la tossina che è la causa principale di gravi infezioni nel tratto gastrointestinale1. I sintomi tipici della CDI includono diarrea, dolore addominale e colite pseudomembranosa fatale, e a volte può portare alla morte1,2. Le prove hanno dimostrato che le risposte immunitarie dell’ospite svolgono un ruolo fondamentale sia nella progressione che nell’esito di questa malattia3. Oltre alla risposta immunitaria, il microbiota intestinale indigeno è fondamentale per l’insorgenza e la patogenesi del CDI4. Nell’ultimo decennio, sia il numero di casi che il tasso di mortalità di CDI sono aumentati in modo significativo a causa dell’emergere di un ceppo ipervirulento di C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Una migliore comprensione dei meccanismi immunitari sottostanti e del ruolo del microbiota durante il CDI contribuirà a portare a nuovi sviluppi e progressi terapeutici, consentendo un migliore controllo di questa epidemia.
Diversi modelli animali, come il criceto e il topo, sono stati sviluppati per fornire informazioni sulla difesa immunitaria contro C. difficile7,8. Tuttavia, il ruolo delle cellule immunitarie innate è ancora poco compreso, soprattutto perché il comportamento delle cellule immunitarie innate è derivato principalmente dall’analisi istologica o dalle cellule coltivate in vitro. Pertanto, stabilire un modello trasparente di pesce zebra per rivelare la risposta immunitaria innata a C. difficile all’interno di un organismo vertebrato vivente faciliterà tali studi. Le larve di pesce zebra hanno un sistema immunitario innato funzionale, ma non hanno il sistema immunitario adattivo fino alle 4-6 settimane dopo la fecondazione9. Questa caratteristica unica rende le larve di pesce zebra un modello eccellente per studiare la risposta isolata e la funzione delle cellule immunitarie innate in CDI.
Questo rapporto descrive nuovi metodi che utilizzano larve di pesce zebra per studiare le interazioni tra C. difficile e cellule immunitarie innate, come macrofagi e neutrofili. In primo luogo, viene presentato un protocollo di microiniezione localizzato che include C. difficile inoculum e colorazione. Utilizzando l’imaging confocaltime in vivo, si registra la risposta dei neutrofili e dei macrofagi verso il sito di infezione e si osserva la fagocitosi dei batteri da neutrofili e macrofagi. Tuttavia, è stato riferito che l’iniezione stessa provoca danni ai tessuti e porta al reclutamento di leucociti indipendentemente dai batteri10. Pertanto, viene descritto successivamente un protocollo di microgavage non invasivo per fornire C. difficile nell’intestino delle larve di pesce zebra. Studi precedenti hanno dimostrato che il microbiota gastrointestinale indigeno protegge un ospite dalla colonizzazione di C. difficile11. Pertanto, le larve di pesce zebra gnotobiotiche sono utilizzate anche per predisporre il pesce zebra che sono infettati 12. Successivamente, viene eseguita la dissezione intestinale per recuperare C. difficile praticabile e convalidare la durata della loro presenza nei tratti intestinali del pesce zebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi presentati modificano ed estendono un approccio esistente per infettare le larve di pesce zebra eseguendo sia iniezione che microgavage10,14. Dimostra anche un approccio per studiare gli agenti patogeni anaerobici con le larve di pesce zebra22. Inoltre, il protocollo facilita l’analisi delle risposte delle cellule immunitarie innate in vivo su CDI e sulla colonizzazione di C. difficile nel pesce zebra. Il metodo è riprod…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati a Timo Fritsch per un’eccellente cura degli animali. Ringraziamo i membri dei laboratori di K’ster e Steinert per il supporto e le discussioni utili. Ringraziamo il dottor Dandan Han per aver letto criticamente il manoscritto. Riconosciamo con gratitudine il finanziamento dello Stato federale della Bassa Sassonia, Nieders-chsisches Vorab (VW-N2889).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
Referências
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
