Desarrollo de un modelo de infección de pez cebra larval para Clostridioides difficile
Summary
Aquí se presenta un método seguro y eficaz para infectar las larvas de pez cebra con C. difficile anaeróbico etiquetado fluorescentemente por microinyección y microvago no invasivo.
Abstract
Clostridioides difficile infección (CDI) se considera una de las infecciones gastrointestinales más comunes asociadas a la atención médica en los Estados Unidos. Se ha descrito la respuesta inmune innata contra C. difficile, pero se entienden menos los roles exactos de los neutrófilos y los macrófagos en la CDI. En el estudio actual, las larvas de Danio rerio (pez cebra) se utilizan para establecer un modelo de infección por C. difficile para tomar imágenes del comportamiento y la cooperación de estas células inmunitarias innatas in vivo. Para monitorear C. difficile, se ha establecido un protocolo de etiquetado utilizando un tinte fluorescente. Una infección localizada se logra mediante microinyección etiquetada C. difficile, que crece activamente en el tracto intestinal del pez cebra e imita el daño epitelial intestinal en CDI. Sin embargo, este protocolo de infección directa es invasivo y causa heridas microscópicas, que pueden afectar los resultados experimentales. Por lo tanto, aquí se describe un protocolo de microgavage más no invasivo. El método consiste en la entrega de células C. difficile directamente en el intestino de las larvas de peces cebra por intubación a través de la boca abierta. Este método de infección imita de cerca la ruta de infección natural de C. difficile.
Introduction
C. difficile es un bacilo grampositivo, formador de esporas, anaeróbico y productor de toxinas que es la principal causa de infecciones graves en el tracto gastrointestinal1. Los síntomas típicos de la ICD incluyen diarrea, dolor abdominal y colitis pseudomembranosa fatal, y a veces puede llevar a la muerte1,2. La evidencia ha demostrado que las respuestas inmunitarias del huésped desempeñan un papel crítico tanto en la progresión como en el resultado de esta enfermedad3. Además de la respuesta inmunitaria, la microbiota intestinal autóctona es crucial para la aparición y la patogénesis de la CDI4. En la última década, tanto el número de casos como la tasa de mortalidad de la CDI han aumentado significativamente debido a la aparición de una cepa hipervirulenta de C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Una mejor comprensión de los mecanismos inmunitarios subyacentes y el papel de la microbiota durante la CdC ayudará a dar lugar a nuevos desarrollos y avances terapéuticos, lo que permitirá un mejor control de esta epidemia.
Varios modelos animales, como el hámster y el ratón, se han desarrollado para proporcionar una visión de la defensa inmune contra C. difficile7,8. Sin embargo, el papel de las células inmunitarias innatas todavía se entiende mal, particularmente porque el comportamiento innato de las células inmunitarias se deriva principalmente del análisis histológico o de las células cultivadas in vitro. Por lo tanto, el establecimiento de un modelo transparente de pez cebra para revelar la respuesta inmune innata a C. difficile dentro de un organismo vertebrado vivo facilitará tales estudios. Las larvas de peces cebra tienen un sistema inmunitario innato funcional, pero carecen del sistema inmunitario adaptativo hasta 4-6 semanas después de la fertilización9. Esta característica única hace que las larvas de pez cebra sean un excelente modelo para estudiar la respuesta aislada y la función de las células inmunitarias innatas en la ICD.
Este informe describe nuevos métodos que utilizan larvas de peces cebra para estudiar las interacciones entre C. difficile y las células inmunitarias innatas, como macrófagos y neutrófilos. En primer lugar, se presenta un protocolo de microinyección localizado que incluye C. difficile inoculum y tinción. Utilizando imágenes confocales in vivo de lapso de tiempo, se registra la respuesta de neutrófilos y macrófagos hacia el sitio de la infección, y se observa la fagocitosis de bacterias por neutrófilos y macrófagos. Sin embargo, se ha informado de que la inyección en sí causa daño tisular y conduce al reclutamiento de leucocitos independientes de la bacteria10. Por lo tanto, posteriormente se describe un protocolo de microgavage no invasivo para administrar C. difficile en el intestino de las larvas de peces cebra. Estudios anteriores han demostrado que la microbiota gastrointestinal indígena protege a un huésped contra la colonización de C. difficile11. Por lo tanto, las larvas de pez cebra gnotobióticas también se utilizan para predisponer el pez cebra que están infectados 12. Después, la disección intestinal se realiza para recuperar la C. difficile viable y validar la duración de su presencia en los tracto intestinales del pez cebra.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los métodos presentados modifican y amplían un enfoque existente para infectar las larvas de peces cebra mediante la realización de inyección y microvaage10,14. También demuestra un enfoque para estudiar patógenos anaeróbicos con larvas de peces cebra22. Además, el protocolo facilita el análisis de las respuestas innatas de las células inmunitarias in vivo sobre el CDI y sobre la colonización de C. difficile en el pez c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos agradecidos a Timo Fritsch por su excelente cuidado animal. Agradecemos a los miembros de los laboratorios de Koster y Steinert el apoyo y las discusiones útiles. Agradecemos al Dr. Dandan Han por leer críticamente el manuscrito. Agradecemos la financiación del Estado Federal de Baja Sajonia, Nieders-chsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
Referências
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