Identification des pièges extracellulaires Neutrophil dans paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi à l’aide de la microscopie à l’immunofluorescence
Summary
Nous décrivons une méthode pour identifier les pièges extracellulaires neutrophiles (NET) dans le formaldéhyde-fixe et paraffin-intégré thrombi cardiogénique félin utilisant la récupération d’antigène induite par la chaleur et un protocole d’immunolabeling double.
Abstract
Les pièges extracellulaires neutrophiles (NET), composés d’ADN sans cellules (CFDNA) et de protéines comme les histones et l’élastase neutrophile (NE), sont libérés par les neutrophiles en réponse à une inflammation systémique ou à des agents pathogènes. Bien qu’il ait déjà été démontré que les TTRO augmentent la formation de caillots et inhibent la fibrinolyse chez l’homme et les chiens, le rôle des NET chez les chats atteints de thromboembolisme artériel cardiogénique (CATE), une complication potentiellement mortelle secondaire à la cardiomyopathie hypertrophique , est inconnu. Une méthode normalisée pour identifier et quantifier les NET dans les thrombi artéraux cardiogéniques chez les chats fera progresser notre compréhension de leur rôle pathologique dans CATE. Ici, nous décrivons une technique pour identifier des NET dans les thrombi formaldéhyde-fixes et paraffin-incorporés dans la bifurcation aortique, extraite pendant l’autopsie. Après la deparaffinisation avec le xylène, les sections aortiques ont subi la récupération indirecte d’antigène thermique-induite. Les sections ont ensuite été bloquées, perméabilisées, et les NET ex vivo ont été identifiés par la colocalisation de l’ADN sans cellule (CFDNA), de l’histone H3 (citH3) et de l’élastase neutrophile (NE) utilisant la microscopie d’immunofluorescence. Pour optimiser l’immunodétection des NET dans thrombi, l’autofluorescence des éléments tissulaires a été limitée en utilisant un processus d’étanchéité de l’autofluorescence avant la microscopie. Cette technique pourrait être un outil utile pour étudier les TNI et la thrombose chez d’autres espèces et offre de nouvelles perspectives sur la pathophysiologie de cette condition complexe.
Introduction
Les chats atteints de cardiomyopathie hypertrophique sont à risque de complications thromboemboliques potentiellement mortelles1,2. En dépit de la morbidité et de la mortalité élevées liées au thromboembolism artériel cardiogénique félin (CATE), la pathophysiologie sous-jacente de CATE chez les chats est mal comprise. Il existe également des outils diagnostiques et thérapeutiques limités pour traiter et identifier les chats à risque de cette condition dévastatrice3.
En plus de son rôle dans l’immunité innée, il a été démontré que les neutrophiles jouent un rôle dans la thrombose en libérant des pièges extracellulaires neutrophiles (NET), qui sont des réseaux web d’ADN sans cellules (CFDNA) incrustés d’histones et de protéines granulaires comme le neutrophile elastase (NE) et le myeloperoxidase. Les neutrophiles subissent la formation de NETs en réponse à l’inflammation systémique, la rencontre directe avec des agents pathogènes, et l’interaction avec les plaquettes activées4,5,6,7. Chez les chiens, l’ADN dérivé du neutrophile a été montré pour inhiber la lyse de caillot, tandis que les protéines NET accélèrent la formation de caillots. La capacité des NET à piéger les cellules circulantes et les composants de coagulation est également la clé de leurs propriétés thrombogéniques8,9,10,11,12.
Les NET sont détectés par colocalisation des protéines neutrophiles extracellulaires, des histones, et de l’ADNC. Pour cette raison, l’identification et la quantification des NET dans les tissus fixes par immunofluorescence des tissus déparaffinisés est supérieure à l’hématoxyline traditionnelle et la tache d’éosine (H et E) utilisant la microscopie de champ lumineux4,5. Plusieurs études humaines utilisant la microscopie d’immunofluorescence ont identifié des NET comme composants structurels de thrombi coronaires, thrombi de course cérébrale, atherothrombose, et thrombi veineux13,14,15,16,17. À ce jour, aucune méthode normalisée permettant de détecter et de quantifier les TNN dans les thrombi félins n’a pas été décrite. Puisque l’identification des NET dans les thrombi artérogènes cardiogéniques félins peut faciliter la recherche translationnelle future dans les NET et la thrombose, nous décrivons des techniques d’identification et d’évaluation de NET dans les thrombi artériels paraffine-embeddeds chez les chats.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons un protocole pour identifier des NET dans les thrombi artérogènes cardiogéniques félins fixes utilisant un protocole d’immunolabeling double et la microscopie d’immunofluorescence. Bien que seulement les thrombi artérogènes cardiogéniques aient été tachés, en théorie ce protocole pourrait être employé pour d’autres types de thrombi et dans d’autres espèces vétérinaires. L’identification des NET dans les thrombi artériels félins suggère que les TN peuvent jouer un rôle dans la…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’étude a été soutenue par des fonds de l’Université de Californie, Davis, Center for Companion Animal Health (CCAH 2018-30-F). Les auteurs aimeraient remercier le Dr Kevin Woolard pour l’utilisation du microscope à fluorescence.
Materials
| 4,6-Diamidino-2-phenylin (DAPI) | Life Technologies Corporation | D1306 | |
| Alexa Fluor 594 Streptavidin conjugate | ThermoFisher Scientific | Catalog # S11227 | |
| Anti-citrullinated histone H3 antibody | Abcam | Ab5103 | |
| EVOS FL Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | AMEFC4300 | |
| EVOS Imaging System Objective 10x | ThermoFisher Scientific | AMEP4681 | NA 0.25, WD 6.9/7.45 mm |
| EVOS Imaging System Objective 20x | ThermoFisher Scientific | AMEP4682 | NA 0.40, WD 6.8 mm |
| EVOS Imaging System Objective 40x | ThermoFisher Scientific | AMEP4699 | NA 0.75, WD 0.72 mm |
| Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | ThermoFisher Scientific | Catalog # A32723 | |
| Goat serum | Jackson Immuno Research Labs | Catalog # NC9660079. Manufacturer Part # 005-000-121 | |
| Neutrophil elastase antibody | Bioss Antibodies | Bs-6982R-Biotin | Rabbit polyclonal Antibody, Biotin conjugated |
| NP40 | Pierce | Product # 28324. Lot # EJ64292 | |
| Positive charged microscope slides | Thomas Scientific | Manufacturer No. 1354W-72 | |
| Rabbit serum | Life Technology | Catalog # 10510 | |
| Target Retrieval Solution | Agilent Dako | S2367 | TRIS/EDTA, pH 9 (10x) |
| TrueVIEW Autofluorescence Quenching Kit | Vector Laboratories | SP-8400 |
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