Síntese de Nanopartículas Magnéticas Funcionalizadas, Sua Conjugação com a Feroxamina Siderophore e sua Avaliação para Detecção de Bactérias
Summary
Este trabalho descreve protocolos para a preparação de nanopartículas magnéticas, seu revestimento com SiO2,seguido por sua funcionalização de amina com (3-aminopropil)triethoxysilane (APTES) e sua conjugação com deferoxamina usando uma moiety de succinil como linker. Uma descrição profunda da caracterização estrutural e um ensaio de bactérias de captura usando Y. enterocolitica para todas as nanopartículas intermediárias e o conjugado final também são descritos em detalhes.
Abstract
No presente trabalho, a síntese de nanopartículas magnéticas, seu revestimento com SiO2,seguido de sua funcionalização amina com (3-aminopropyl)triethoxysilane (APTES) e sua conjugação com deferoxamina, um siderophore reconhecido por Yersinia enterocolitica,usando um moiety de succinyl como linker são descritos.
As nanopartículas magnéticas (MNP) de magnetita (Fe3O4) foram preparadas pelo método solvothermal e revestidas com SiO2 (MNP@SiO2) utilizando o processo stöber seguido de funcionalização com APTES (MNP@SiO2@NH2). Em seguida, a feroxamina foi conjugada com o MNP@SiO2@NH2 por acoplamento de carbodiimídeo para dar MNP@SiO2@NH2@Fa. A morfologia e as propriedades dos conjugados e intermediários foram examinadas por oito métodos diferentes, incluindo difração de raios-X em pó (XRD), espectroscopia infravermelha de transformação fourier (FT-IR), espectroscopia de Raman, espectroscopia fotoeletrântrica de raios-X (XPS), microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e mapeamento de raios-X dispersivos de energia (EDX). Essa caracterização exaustiva confirmou a formação do conjugado. Finalmente, para avaliar a capacidade e especificidade das nanopartículas, elas foram testadas em um ensaio de bactérias de captura utilizando Yersinia enterocolitica.
Introduction
Os métodos de detecção de bactérias que utilizam MNP baseiam-se no reconhecimento molecular de anticorpos, aptamers, bioproteínas, carboidratos conjugados ao MNP pela bactéria patogênica1. Levando-se em conta que os siderophores são reconhecidos por receptores específicos na membrana externa das bactérias, eles também podem estar ligados ao MNP para aumentar sua especificidade2. Siderophores são pequenas moléculas orgânicas envolvidas na absorção do Fe3+ por bactérias3,4. A preparação de conjugados entre siderophores e MNP, juntamente com sua avaliação para a captura e isolamento de bactérias ainda não foi relatada.
Um dos passos cruciais na síntese de conjugados de nanopartículas magnéticas com pequenas moléculas é a seleção do tipo de ligação ou interação entre eles para garantir que a pequena molécula seja anexada à superfície do MNP. Por essa razão, o procedimento para preparar o conjugado entre nanopartículas magnéticas e feroxamina — o siderophore reconhecido pela Yersinia enterocolitica— foi focado na geração de uma superfície modificável do MNP para permitir ligá-lo covalentemente ao siderophore pela química de carbodiimídeo. A fim de obter uma nanopartículas magnetita uniforme (MNP) e melhorar a nucleação e controle de tamanho, uma reação de solvolise com álcool benzílico foi transportada em um bloco térmico sem tremer5. Em seguida, um revestimento de sílica foi gerado pelo método Stöber para conferir proteção e melhorar a estabilidade da suspensão das nanopartículas na mídia aquosa6. Levando-se em conta a estrutura da feroxamina, a introdução de grupos de amina é necessária para produzir nanopartículas adequadas (MNP@SiO2@NH2) a serem conjugadas com o siderophore. Isso foi conseguido por condensação de (3-aminopropil)triethoxysilano (APTES) com os grupos de álcool presentes na superfície das nanopartículas modificadas de sílica (MNP@SiO2) utilizando um método sol-gel7.
Paralelamente, o complexo de ferro feroxamina (III) foi preparado pela complexidade da deferoxamina comercialmente disponível com acetonato de acetil de ferro em solução aquosa. N-succinylferoxamina, com grupos de succinil que atuarão como eloers, foi obtido pela reação de feroxamina com anidrido succinico.
A conjugação entre MNP@SiO2@NH2 e N-succinylferoxamine para dar MNP@SiO2@NH@Fa foi realizada através da química de carbodiícida usando como reagentes de acoplamento benzotriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-fosfônio hexafluorophosphate (BOP) e 1-hidroxibenzotriazole (HOBt) em uma mídia básica suave para ativar o grupo ácido terminal em N-succinylferoxamina8.
Uma vez caracterizados os MNPs, avaliamos as capacidades de nanopartículas magnéticas nuas e funcionalizadas para capturar o tipo selvagem (WC-A) e um mutante de Y. enterocolitica sem receptor de feroxamina FoxA (FoxA WC-A 12-8). MNPs simples, MNPs funcionalizados e os MNP@SiOconjugados 2@NH@Fa foram autorizados a interagir com cada cepa Y. enterocolitica. Os agregados de bactérias conjugadas foram separados da suspensão das bactérias pela aplicação de um campo magnético. Os agregados separados foram enxaguados duas vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), re-suspenso na PBS para preparar diluições seriais e, em seguida, foram banhados para contagem de colônias. Este protocolo demonstra cada passo da síntese de MNP@SiO2@NH@Fa, a caracterização estrutural de todos os intermediários e do conjugado, e um ensaio de captura de bactérias como uma forma fácil de avaliar a especificidade do conjugado em relação aos intermediários. 9
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a síntese de um conjugado entre nanopartículas magnéticas e feroxamina siderophore por ligação covalente. A síntese de magnetita foi realizada utilizando-se o protocolo relatado por Pinna et al.5 seguido de revestimento de sílica para proteger o núcleo magnético da corrosão em sistemas aquosos, minimizar a agregação e fornecer uma superfície adequada para a funcionalização6. O processo de revestimento de sílica foi modificado. Em vez …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem com gratidão o professor Klaus Hantke (Universidade de Tübingen, Alemanha) por fornecer gentilmente as cepas enterocoliticas de Yersinia usadas neste trabalho. Este trabalho foi apoiado pelas bolsas AGL2015-63740-C2-1/2-R e RTI2018-093634-B-C21/C22 (AEI/FEDER, UE) da Agência Estatal de Pesquisa (AEI) da Espanha, co-financiada pelo Programa FEDER da União Europeia. O trabalho na Universidade de Santiago de Compostela e na Universidade de A Coruña também foi apoiado pelas bolsas GRC2018/018, GRC2018/039 e ED431E 2018/03 (grupo estratégico CICA-INIBIC) da Xunta de Galícia. Finalmente, queremos agradecer a Nuria Calvo por sua grande colaboração fazendo o protocolo de dublador deste vídeo.
Materials
| 1-Hydroxybenzotriazole hydrate HOBT |
Acros | 300561000 | |
| 2,2′-Bipyridyl | Sigma Aldrich | D216305 | |
| 3-Aminopropyltriethoxysilane 99% | Acros | 151081000 | |
| Ammonium hydroxide solution 28% NH3 | Sigma Aldrich | 338818 | |
| Benzotriazol-1-yloxytris(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate BOP Reagent | Acros | 209800050 | |
| Benzyl alcohol | Sigma Aldrich | 822259 | |
| Deferoxamine mesylate salt >92,5% (TLC) | Sigma Aldrich | D9533 | |
| Ethanol, anhydrous, 96% | Panreac | 131085 | |
| Ethyl Acetate, Extra Pure, SLR, Fisher Chemical | |||
| Iron(III) acetylacetonate 97% | Sigma Aldrich | F300 | |
| LB Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022 | |
| N,N-Diisopropylethylamine, 99.5+%, AcroSeal | Acros | 459591000 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 326871000 | |
| Pyridine, 99.5%, Extra Dry, AcroSeal | Acros | 339421000 | |
| Sephadex LH-20 | Sigma Aldrich | LH20100 | |
| Succinic anhydride >99% | Sigma Aldrich | 239690 | |
| Tetraethyl orthosolicate >99,0% | Sigma Aldrich | 86578 |
Referências
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