Farelerde Alt Karın Organları nın ve Arka Ekstremitelerin Situ Kapalı Devre Perfüzyonunun Oluşturulması
Summary
Bir protokol mesane, prostat, cinsel organlar, kemik, kas ve ayak derisi de dahil olmak üzere fare alt vücut, yerinde perfüzyon için açıklanmıştır.
Abstract
Ex vivo perfüzyon izole organların işlevini incelemek için önemli bir fizyolojik araçtır (örneğin karaciğer, böbrekler). Aynı zamanda, fare organlarının küçük boyutu nedeniyle, kemik ex vivo perfüzyon, mesane, cilt, prostat, ve üreme organları zor ya da mümkün değildir. Burada, ilk kez yukarıdaki dokuları içeren farelerde bir in situ alt vücut perfüzyon devresi rapor, ancak ana temizleme organları atlar (böbrek, karaciğer, ve dalak). Devre iliak arter ve ven üzerinde abdominal aort ve inferior vena kava cannulating ve periferik kan damarları cauterizing tarafından kurulur. Perfüzyon perfusate akışı ile peristaltik bir pompa ile yapılır 2 saate kadar. Floresan lektin ve Hoechst çözeltisi ile yerinde boyama mikrovaskülatür başarıyla perfüzyon olduğunu doğruladı. Bu fare modeli patolojik süreçlerin yanı sıra ilaç dağıtım mekanizmaları, tümör içine / tümör den dolaşımdaki tümör hücrelerinin göç / metastaz ve perfüzyon organ ve dokular ile bağışıklık sisteminin etkileşimleri incelemek için çok yararlı bir araç olabilir.
Introduction
İzole organ perfüzyonu ilk olarakorganfizyolojisi 1,2,3olmak üzere geliştirilmiş ve diğer vücut sistemlerinden müdahale edilmeden organların fonksiyonlarının anlaşılmasını sağlamıştır. Örneğin, izole böbrek ve kalp perfüzyonu hemodinamik ve vazoaktif ajanların etkileri nin temel ilkelerini anlamada son derece yararlı oldu, karaciğer perfüzyonu metabolik fonksiyonu anlamak için önemli olduğu ise, sağlıklı ve hastalıklı doku ilaç metabolizması da dahil olmak üzere4,5,6,7. Buna ek olarak, perfüzyon çalışmaları transplantasyon alabilme amaçlı organların canlılığını ve işlevini anlamada kritik öneme sahip oldu. Kanser Researchearch yılında, izole tümör perfüzyon fare kullanarak çeşitli gruplar tarafından tarif edilmiştir, sıçan, ve taze rezeke insan dokuları8,9. Bazı izole tümör perfüzyon, tümör mezenter arter10kan damarları temin eden tümörün büyümesini zorlamak için yumurtalık yağ pedi implante edildi. Jain grubu tümör hemodinamik ve metastazanlamakiçin kolon adenokarsinomların izole perfüzyon kullanarak öncü çalışmalar yaptı 8,11,12,13. Diğer yenilikçi mühendislik ex vivo kurulumları kültür birincil insan multipl miyelom hücreleri14 ve mühendislik kemik iliği mimarisi ve fonksiyon araştırma15için modüler bir akış odası için 96-iyi plaka tabanlı perfüzyon cihazı içerir.
Fizyoloji ve patoloji çalışmalarının yanı sıra, organ perfüzyonu ilaç dağıtımının temel ilkelerini incelemek için de kullanılmıştır. Böylece, bir grup izole sıçan ekstremite perfüzyonu açıklanan ve implante sarkomlarda lipozombirikimi okudu16, başka bir grup nano tanecikleri endotel hedefleme çalışması için insan böbrek perfüzyon diseksiyon yapıldı17. Ternullo ve ark. yakın-in-in vivo cilt ilaç penetrasyon modeli olarak izole perfüzyon insan deri flep kullanılır18.
Büyük organ ve dokuların perfüzyonbu gelişmelere rağmen, farelerde situ perfüzyon modellerinde hiçbir rapor olmuştur: a) karaciğer, dalak ve böbrekler gibi sızma temizleme organları; b) pelvik organlar, deri, kas, üreme organları (erkek), mesane, prostat ve kemik iliği içerir. Bu organların küçük boyutu ve temin vaskülatür nedeniyle, ex vivo kanülasyon ve perfüzyon devresi kurulması mümkün olmamıştır. Fare kanser ve immünoloji araştırmalarında en önemli hayvan modeli, ve ilaç teslim. Küçük fare organları perfuse yeteneği bu organlara ilaç teslimi ile ilgili ilginç sorular sağlayacak, pelvis implante tümörler de dahil olmak üzere (mesane, prostat, yumurtalık, kemik iliği), cevaplanması, yanı sıra temel fizyoloji ve bu organların hastalıkların immünoloji çalışmaları. Bu eksikliği gidermek için, farelerde doku yaralanmasını önleyebilecek ve izole organ perfüzyonuna göre fonksiyonel araştırmalar için çok daha uygun olan bir in situ perfüzyon devresi geliştirdik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan devre çeşitli araştırma sorularını araştırmak için kullanılabilir, örneğin ilaç dağıtımında farklı serum bileşenleri ve doku bariyerlerinin rolü, ya da bağışıklık ve kök hücre ticareti. Farklı ilaç dağıtım sistemleri (örneğin, lipozomlar ve nano tanecikleri) teslimatta fizyolojik ve biyokimyasal faktörlerin rolünü anlamak için perfusata eklenebilir. Perfüzyon süresi, incelenen doku, bilimsel hedefler ve perfusat bileşimine bağlı olarak değişebilir. Ringer’ın lakta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışma NIH hibe CA194058 tarafından DS, Skaggs School of Pharmacy ADR tohum hibe programı (DS) desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Hibe No. 31771093), Jilin Eyaleti Uluslararası İşbirliği Projesi (No.201180414085GH), Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları, JLU Bilim ve Teknoloji Yenilikçi Araştırma Ekibi Programı (2017T-27, 2019TD-36).
Materials
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
Referências
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125 (2019).
- Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
- Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419 (2014).
- Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. Gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).
- Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Pesquisa do Câncer. 49 (13), 3513-3519 (1989).
- Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
- Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Pesquisa do Câncer. 53 (20), 4764-4766 (1993).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Pesquisa do Câncer. 49 (13), 3506-3512 (1989).
- Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
- Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
- Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
- Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986 (2008).
- Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
- Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Pesquisa do Câncer. 51 (3), 841-849 (1991).
