Etablierung von In Situ Closed Circuit Perfusion von unteren Bauchorganen und Hinterbeinen bei Mäusen
Summary
Ein Protokoll wird für die In-situ-Perfusion des Unterkörpers der Maus beschrieben, einschließlich der Blase, der Prostata, der Geschlechtsorgane, des Knochens, des Muskels und der Fußhaut.
Abstract
Ex-vivo-Perfusion ist ein wichtiges physiologisches Werkzeug, um die Funktion isolierter Organe (z. B. Leber, Nieren) zu untersuchen. Gleichzeitig ist die Ex-vivo-Perfusion von Knochen, Blase, Haut, Prostata und Fortpflanzungsorganen aufgrund der geringen Größe der Mausorgane eine Herausforderung oder nicht machbar. Hier berichten wir zum ersten Mal von einem In-situ-Unterkörper-Perfusionskreislauf bei Mäusen, der die oben genannten Gewebe umfasst, aber die wichtigsten Clearance-Organe (Niere, Leber und Milz) umgeht. Der Kreislauf wird durch Konserven der Abdominalaorta und der unteren Vena cava über der Iliasarterie und Vene und kauterisierenden peripheren Blutgefäßen hergestellt. Die Perfusion erfolgt über eine peristaltische Pumpe mit Perfusatenstrom, der bis zu 2 h gehalten wird. Die In-situ-Färbung mit fluoreszierendem Lektin und der Hoechst-Lösung bestätigte, dass die Mikrovaskulatur erfolgreich durchdrungen wurde. Dieses Mausmodell kann ein sehr nützliches Werkzeug für die Untersuchung pathologischer Prozesse sowie Mechanismen der Medikamentenabgabe, Migration/Metastasierung zirkulierender Tumorzellen in/aus dem Tumor und Wechselwirkungen des Immunsystems mit durchsetzten Organen und Geweben sein.
Introduction
Isolierte Organperfusion wurde ursprünglich entwickelt, um Organphysiologie für Transplantation1,2,3zu studieren und ermöglichte das Verständnis der Funktionen der Organe ohne Störungen durch andere Körpersysteme. Zum Beispiel, isolierte Nieren- und Herzperfusion war immens nützlich für das Verständnis der Grundprinzipien der Hämodynamik und Der Wirkung von vasoaktiven Wirkstoffen, während Leberperfusion war wichtig, um die metabolische Funktion zu verstehen, einschließlich Desarzneimittelstoffwechsel in gesundem und krankem Gewebe4,5,6,7. Darüber hinaus waren Perfusionsstudien entscheidend für das Verständnis der Lebensfähigkeit und Funktion von Organen, die für die Transplantation bestimmt sind. In Cancer Researchearch wurde die isolierte Tumorperfusion von mehreren Gruppen mit Maus, Ratte und frisch resektierten menschlichen Gewebenbeschrieben 8,9. Bei einer isolierten Tumorperfusion wurde der Tumor in das Eierstockfettpad implantiert, um das Wachstum von Tumoren zu erzwingen, die Blutgefäße aus der mesentery arterienden10versorgen. Die Jain-Gruppe führte bahnbrechende Studien mit isolierter Perfusion von Darmadenokarzinomen durch, um Tumorhämodynamik und Metastasen8,11,12,13zu verstehen. Weitere innovative Ex-vivo-Setups sind ein 96-Well-Platten-basiertes Perfusionsgerät zur Kultur der primären menschlichen Multiple-Myelom-Zellen14 und eine modulare Durchflusskammer für die technische Knochenmarkarchitektur und Funktionsforschung15.
Neben Physiologie- und Pathologiestudien wurde die Organperfusion verwendet, um die Grundprinzipien der Medikamentenabgabe zu untersuchen. So beschrieb eine Gruppe die isolierte Rattengliederperfusion und untersuchte die Anhäufung von Liposomen bei implantierten Sarkomen16, während eine andere Gruppe eine sezierte menschliche Nierenperfusion durchführte, um die endotheliale Ausrichtung von Nanopartikeln zu untersuchen17. Ternullo et al. verwendeten eine isolierte perfundierte menschliche Hautklappe als nah in vivoHautarzneimittelPenetrationsmodell 18.
Trotz dieser Fortschritte bei der Durchblutung großer Organe und Gewebe, gab es keine Berichte über In-situ-Perfusionsmodelle bei Mäusen, die: a) Bypass-Clearance-Organe wie Leber, Milz und Nieren; b) Beckenorgane, Haut, Muskel, Fortpflanzungsorgane (männlich), Blase, Prostata und Knochenmark. Aufgrund der geringen Größe dieser Organe und der zuliefernden Vaskulatur war eine Ex-vivo-Kanülierung und der Aufbau eines Perfusionskreislaufs nicht möglich. Die Maus ist das wichtigste Tiermodell in der Krebs- und Immunologieforschung und der Medikamentenabgabe. Die Fähigkeit, kleine Mausorgane zu durchdringen, würde es ermöglichen, interessante Fragen bezüglich der Medikamentenabgabe an diese Organe zu beantworten, einschließlich zu Tumoren, die in das Becken implantiert wurden (Blase, Prostata, Eierstock, Knochenmark), sowie Studien über grundlegende Physiologie und Immunologie von Erkrankungen dieser Organe. Um diesen Mangel zu beheben, haben wir bei Mäusen einen In-situ-Perfusionskreislauf entwickelt, der möglicherweise Gewebeverletzungen vermeiden kann und sich viel besser für die funktionelle Forschung eignet als isolierte Organperfusion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der beschriebene Kreislauf kann verwendet werden, um verschiedene Forschungsfragen zu untersuchen, zum Beispiel die Rolle verschiedener Serumkomponenten und Gewebebarrieren bei der Medikamentenabgabe oder Immun- und Stammzellhandel. Verschiedene Arzneimittelabgabesysteme (z.B. Liposomen und Nanopartikel) können dem Perfusate hinzugefügt werden, um die Rolle physiologischer und biochemischer Faktoren bei der Abgabe zu verstehen. Die Dauer der Perfusion kann variieren, abhängig von dem untersuchten Gewebe, wissenschaftl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde durch das NIH-Stipendium CA194058 an DS, Skaggs School of Pharmacy ADR Seed Grant Program (DS) unterstützt; National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771093), das Project of International Collaboration of Jilin Province (No.201180414085GH), die Fundamental Research Funds for the Central Universities, das Program for JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
Referências
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