마우스에서 하복부 장기 및 뒷다리의 시투 폐쇄 회로 관류 에 설립
Summary
프로토콜은 방광, 전립선, 성기관, 뼈, 근육 및 발 피부를 포함한 마우스 하반신의 시상 수혈에 대해 설명된다.
Abstract
Ex 생체 내 관류는 고립 된 장기 (예 : 간, 신장)의 기능을 연구하는 중요한 생리적 도구입니다. 동시에, 마우스 장기의 작은 크기로 인해 뼈, 방광, 피부, 전립선 및 생식 기관의 전 생체 풍부는 도전적이거나 불가능합니다. 여기서, 우리는 상기 조직을 포함하는 마우스에 있는 시투 하체 관류 회로에서 처음으로 보고합니다, 그러나 주요 정리 기관 (신장, 간 및 비장)를 우회합니다. 회로는 상복부 대동맥과 정맥 위에 복부 대동맥과 열등한 베나 카바를 캔터링하고 말초 혈관을 소작함으로써 확립된다. 관류는 최대 2시간 동안 유지되는 난투류 흐름을 가진 연동 펌프를 통해 수행됩니다. 형광 렉틴 과 Hoechst 용액으로 시투 염색에서 마이크로 혈관이 성공적으로 침투된 것을 확인했습니다. 이 마우스 모형은 병리학적인 프로세스뿐만 아니라 약물 전달의 기계장치, 종양에서 종양 세포를 순환하는 이동/전이, 그리고 관전된 기관 및 조직과의 면역 계통의 상호 작용을 연구하기 위한 아주 유용한 공구일 수 있습니다.
Introduction
고립 된 기관 관류는 원래 이식에대한 장기 생리학을 연구하기 위해 개발되었다1,2,,3,다른 신체 시스템에서 간섭없이 장기의 기능에 대한 이해를 가능하게. 예를 들어, 고립 된 신장과 심장 관류는 혈역학의 기본 원리와 혈관 활성제의 효과를 이해하는 데 대단히 유용했지만, 간 관류는 건강하고 병은 조직4,,5,,6,,7에서약물 대사를 포함한 대사 기능을 이해하는 데 중요했다. 또한, 관류 연구는 이식을 위한 장기의 생존력과 기능을 이해하는 데 중요했습니다. 암 연구에서, 고립 된 종양 관류는 마우스, 쥐 및 갓 절제 된 인간 조직을 사용하여 여러 그룹에 의해 설명되었다8,,9. 일부 고립된 종양 관류에서, 종양은 난소 지방 패드에 이식되어 간질동맥(10)으로부터혈관을 공급하는 종양의 성장을 강요했다. Jain 그룹은 종양 혈역학 및 전이를 이해하기 위해 결장 아데노시스종의 고립 된 관류를8사용하여 선구적인 연구를 수행8,11,,12,,13. 다른 혁신적인 엔지니어링 된 ex vivo 설정은 주요 인간 다발성 골수종 세포(14)를 배양하는 96 웰 플레이트 기반 관류 장치와 골수 아키텍처 및 기능 연구를 엔지니어링하기위한 모듈식 유동챔버를 포함한다.
생리학 및 병리학 연구 이외에, 기관 관류는 약 납품의 기본 원리를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 따라서, 한 그룹은 이식된육종16에서분리된 쥐 사지 관류를 설명하고 리포솜의 축적을 연구한 반면, 다른 그룹은나노입자(17)의내피 표적을 연구하기 위해 해부된 인간 신장 관류를 수행하였다. Ternullo 외. 가까운 생체 내 피부 약물 침투 모델로 고립 된 인체 피부 플랩을 사용 하 여18.
큰 장기와 조직의 관류에 있는 이 발전에도 불구하고, 마우스에 있는 situ perfusion 모형에 에 아무 보고도 없었습니다: a) 간, 비장 및 신장과 같은 통관 기관을 우회합니다; b) 골반 장기를 포함, 피부, 근육, 생식 기관 (남성), 방광, 전립선과 골수. 이러한 장기의 작은 크기와 공급 혈관으로 인해, 전 생체 캐닝 및 관류 회로의 설립은 실현 가능하지 않았습니다. 마우스는 암 과 면역학 연구, 및 약물 전달에서 가장 중요한 동물 모델입니다. 작은 마우스 기관을 인퍼퓨즈하는 능력은 골반 (방광, 전립선, 난소, 골수)에 이식 된 종양을 포함하여 이러한 장기에 대한 약물 전달에 관한 흥미로운 질문뿐만 아니라 이러한 장기의 질병의 기본 생리학 및 면역학에 대한 연구를 허용합니다. 이 결핍을 해결하기 위하여는, 우리는 잠재적으로 조직 상해를 피할 수 있고 고립된 기관 관류 보다는 기능적인 연구에 훨씬 더 적합한 마우스에 있는 시투 관혈 회로를 개발했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 회로는 각종 연구 질문, 예를 들어 약물 전달에 있는 상이한 혈청 성분 및 조직 장벽의 역할, 또는 면역 및 줄기 세포 밀매를 탐구하기 위하여 이용될 수 있다. 상이한 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포솜 및 나노입자)은 전달에서 생리학적 및 생화학적 인자의 역할을 이해하기 위해 서두자에 첨가될 수 있다. 관류의 지속 기간은 연구 된 조직, 과학적 목표 및 perfusate의 구성에 따라 다를 수 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구 결과는 DS, 약학 ADR 종자 교부금 프로그램의 Skaggs 학교에 NIH 교부금 CA194058에 의해 지원되었습니다 (DS); 중국 국립자연과학재단(교부금 제31771093), 지린성 국제협력프로젝트(20180414085GH), 중앙대학의 기초연구기금, JLU 과학기술혁신연구팀 프로그램(2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
Referências
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