Opsono-דבקות Assay כדי להעריך נוגדנים תפקודיים בפיתוח חיסונים נגד אנתרקיס Bacillus ופתוגנים אנקפסולציה אחרים
Summary
הבדיקה האופסונו-דבקות היא שיטה חלופית למבצע ההרג האופוסונו-פאגוציטי כדי להעריך את הפונקציות האופסיוניות של נוגדנים בפיתוח חיסונים.
Abstract
מבחני דבקות האופסונו הוא בדיקה פונקציונלית המונים את ההחזקה של פתוגנים חיידקיים לפגוציטים מקצועיים. מכיוון שדבקות היא דרישה לפגוציטוזיס והרג, ההאשמה היא שיטה חלופית למבצעי הרג אופסונו-פגוציטיים. היתרון של בדיקת דבקות באופסונו הוא האפשרות להשתמש בפתוגנים מומתים ובקווי תאים של יונקים, המאפשרים סטנדרטיזציה על פני ניסויים מרובים. השימוש בפתוגן מושבת ב assay גם מקל על העבודה עם סוכנים זיהומיות ברמה biosafety 3 ופתוגנים ארסיים אחרים. בעבודתנו, נעשה שימוש ב-opsono-adherence assay כדי להעריך את היכולת התפקודית של נוגדנים, החל מ-sera של בעלי חיים מחוסנים עם חיסון מבוסס קפסולה אנתרקס, כדי לגרום לדבקות באצילוס אנתרקיס קבוע לקו תא מקרופאג עכבר, RAW 264.7. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אוטומטית שימשה ללכידת תמונות של bacilli דבק מקרופאגים. דבקות מוגברת הייתה בקורלציה עם נוכחות של נוגדנים נגד כמוסות בסרום. יונקים לא אנושיים שהפגינו ריכוזי נוגדנים גבוהים נגד קפסולה בסרום היו מוגנים מפני אתגר אנתרקס. לפיכך, ניתן להשתמש בפקודת האופסונו-דבקות כדי להבהיר את הפונקציות הביולוגיות של נוגדנים ספציפיים לאנטיגן בסרה, להעריך את יעילותם של מועמדים לחיסון וטיפולים אחרים, ולשמש כמתאם אפשרי של חסינות.
Introduction
הכרה, דבקות, הפנמה והשפלה של פתוגן הם חלק בלתי נפרד phagocytosis1, מסלול בולט בתגובה החיסונית המולדת המארחת שתוארה לראשונה על ידי איליה מצ’ניקוף בשנת 18832,3. לויקוציטים Phagocytic, כמו גם תאים אחרים של המערכת החיסונית, הם מפלים מאוד בבחירת המטרות שלהם; הם מסוגלים להבחין בין “זיהומיות לא עצמי” ו “עצמי לא זיהומיות” באמצעות דפוסים מולקולריים הקשורים פתוגן על ידי הרפרטואר שלהם של קולטני זיהוי דפוס (PRRs)4,5. זיהוי מארח של פתוגן עלול להתרחש גם עם כריכה של opsonins המארח, כגון משלימים ונוגדנים6. תהליך זה, הנקרא opsonization, מצופה את הפתוגן עם מולקולות אלה, שיפור הפנמה על מחייב קולטנים opsonic (למשל, משלימים קולטני Fc) על תאים phagocytic6. עבור פתוגן לדבוק phagocyte, כריכה קולקטיבית של קולטנים מרובים עם ליגנדים קוגנט שלהם יש צורך. רק אז יכול ההדק דבקות ולקיים מדורגים איתות בתוך התא המארח ליזום הפנמה6.
בשל החשיבות של phagocytosis בסיווג של פתוגנים ומניעת זיהום, פתוגנים חוץ תאיים פיתחו דרכים רבות לחתור תחת תהליך זה כדי להאריך את הישרדותם. אסטרטגיה אחת בעלת חשיבות היא ייצור כמוסה פולימרית אניונית (למשל, פוליסכריד או חומצת פוליאמינו) שהיא אנטי-פגוציטית מתוקף המטען שלה, היא אימונוגנית גרועה, ומגינה על מולקולות על מעטפת החיידקים מ PRRs6,7. פתוגנים כגון Cryptococcus neoformans ו דלקת ריאות סטרפטוקוקוס יש כמוסות המורכבות פולימרים סכריד, ואילו אפידרמידים סטפילוקוקוס וכמה מינים Bacillus לייצר חומצה פולי-ɣ גלוטמית (PGGA)7,8. עם זאת, פתוגנים אחרים מייצרים כמוסות הדומות לעצמי הלא מדבק. לדוגמה, pyogenes סטרפטוקוקוס זן פתוגניים של B. cereus יש כמוסה חומצה היאלורונית כי הוא לא רק אנטי phagocytic אבל אשר גם לא יכול להיות מוכר זר על ידי המערכת החיסונית9,10.
הטיה של כמוסה לחלבוני נשא ממירה אותם מאנטיגנים עניים ובלתי תלויים T לאנטיגנים תלויי T אימונוגניים ביותר שיכולים לגרום לתיבת נוגדנים גבוהה נגד כמוסות בסרום11,12. אסטרטגיה זו משמשת לחיסונים מורשים נגד S. דלקת ריאות, שפעת ההמופילוס, ו Neisseria מנינגיטידים11. הפעילויות האופסיוניות של נוגדנים נגד קפסולה הוערכו בדרך כלל על ידי מבחני הרג opsono-phagocytic (OPKA)13,14,15,16. מבחנים אלה בודקים אם נוגדנים תפקודיים יכולים לגרום לפגוציטוזיס ולהרוג14. עם זאת, השימוש OPKA עם פתוגנים זיהומיות, כגון רובד 1 ביולוגי בחר סוכנים ורעלים (BSAT), כולל B. anthracis17, הוא מסוכן ומציג סיכוני אבטחה; מבחנים אלה מחייבים טיפול נרחב בסוכן נבחר. טיפול בסוכן נבחר יכול להיעשות רק במעבדות מוגבלות ברמת 3 (BSL-3); העבודה באזורים אלה דורשת נהלי הפעלה ממושכים בשל אמצעי הבטיחות והאבטחה הרבים שיש לנקוט. מעבדות BSL-3 גם בדרך כלל אינן מצוידות בציוד מיוחד המשמש לעבודת OPKA, כגון מיקרוסקופים וציטומטרים. לכן, פיתחנו מבחנים חלופיים המבוססים על שימוש בחיידקים מומתים18,19. אנו מתייחסים לזה כאל מבחני דבקות באופסונו (OAA) שאינו תלוי בהפנמה והרג כתפוקות מבחנים; במקום זאת, הדבקות של פתוגנים מומתים opsonized משמש כאינדקס של phagocytosis. מבחינה מכנית, OAA הוא תחליף מתאים כי הדבקות מתרחשת פריורי והוא שזורה באופן אינטימי עם הפנמה והרג תאי. מנקודת מבט של biosafety, OAA הוא המועדף כי זה דורש טיפול מינימלי של סוכן זיהומיות, הוא ניסיוני של משך זמן קצר יותר מאשר OPKA, והוא יכול להתבצע במעבדות BSL-2 לאחר מלאי של פתוגן מושבת הופק והועבר.
אנו מדגימים את הניצול של OAA כדי לבחון את הפונקציה האופסיונית של נוגדנים נגד קפסולה שנמצאו בשרה של פרימטים לא אנושיים (NHPs) שחוסנו עם מצומד קפסולה [כלומר PGGA מ- B. anthracis הקשורים לתסביך חלבון הקרום החיצוני (OMPC) של מנינגיטידים Neisseria]20. bacilli opsonized סרום היו דגירה עם קו תא מקרופאג עכבר חסידים, RAW 264.7. לאחר הקיבעון, המונוליילר של התא ובצילי החסיד צולמו על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הדבקות החיידקית גדלה כאשר bacilli היו דגירה עם סרום מ NHPs מחוסנים עם הקפסולה להצעיר לעומת סרום שליטה20. דבקות בקורלציה עם הישרדות אתגר האנתרקס20,21. לכן, השימוש ב- OAA אפיין את הפונקציה של נוגדנים נגד קפסולה והקלה מאוד על בדיקות של מועמד החיסון שלנו.
Protocol
Representative Results
Discussion
חיסונים מבוססי כמוסות הוכחו כיעילים נגד פתוגנים חיידקיים רבים, ורבים מורשים לשימוש בבני אדם25,26,27. חיסונים אלה פועלים על ידי יצירת נוגדנים המכוונים לקפסולה ורבים ממחקרים אלה משתמשים ב- OPKA כדי להראות את הפונקציות האופוסונו-פגוציטיות של הנ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ג’יי צ’ואה, ד. צ’בוט וא. פרידלנדר עיצבו את ההליכים המתוארים בכתב היד. ג’יי צ’ואה ות’, פוטמון-טיילור, ביצעו את הניסויים. ד. צ’בוט ביצע ניתוח נתונים. ג’יי צ’ו כתב את כתב היד.
המחברים מודים לקייל ג’יי פיטס על סיוע טכני מצוין.
העבודה נתמכה על ידי הסוכנות להפחתת איומים ביטחוניים CBM. VAXBT.03.10.RD.015, תוכנית מספר 921175.
דעות, פרשנויות, מסקנות והמלצות הן של המחברים ואינן בהכרח מאושרות על ידי צבא ארה”ב. תוכנו של פרסום זה אינו משקף בהכרח את השקפותיו או מדיניותו של משרד ההגנה, ואינו מזכיר שמות מסחריים, מוצרים מסחריים או ארגונים המרמזים על תמיכה של ממשלת ארה”ב.
Materials
| 0.20 µm syringe filter (25mm, regenerated cellulose) | Corning, Corning, NY | 431222 | |
| 10 mL syringe (Luer-Lok tip) | BD, Franklin Lakes, NJ | 302995 | |
| 15µ 96 well black plates (plate #1 for imaging) | In Vitro Scientific, Sunnyvale, CA | P96-1-N | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 15710 | |
| 75 cm sq. tissue culture treated flask | Corning, Corning, NY | 430641 | |
| Agar (powder) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1296 | |
| Baby Rabbit Complement | Cedarlane Labs, Burlington, NC | CL3441 | |
| Bacto Yeast Extract | BD, Sparks, MD | 288620 | |
| BBL Brain Heart Infusion (BHI) | BD, Sparks, MD | 211059 | |
| Blood Agar (TSA with Sheep Blood) plates | Remel, Lenexa, KS | R01198 | |
| Cell scraper | Sarstedt, Newton, NC | 83.183 | |
| Costar 96 well cell culture plates (plates #2 & 3 for dilutions) | Corning, Corning, NY | 3596 | |
| Cover glass | Electron Microscopy Science, Hatfield, PA | 72200-10 | |
| Difco Nutrient Broth | BD, Sparks, MD | 234000 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 11965-092 | contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red |
| EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope) | Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AMAFD1000 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SH30071.03 | not gamma irradiated, not heat inactivated |
| Fluorescein isothiocyanate | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | F143 | |
| HCS Cell Mask Orange Cell Stain | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | H32713 | |
| hemocytometer (Improved Neubauer) | Hausser Scientific, Horsham, PA | 3900 | |
| India Ink solution | BD, Sparks, MD | 261194 | |
| L- glutamine (200 mM) | Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham MA | 25030081 | supplement medium with additional 2mM L-glutamine |
| Nikon Eclipse TE2000-U (inverted compound microscope) | Nikon Instruments, Melville, NY | TE2000 | |
| PBS without Calcium or Magnesium | Lonza, Walkersville, MD | 17-516F | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT | SV30010 | |
| petri dishes (100 x 15 mm) | Falcon, Corning, Durham, NC | 351029 | for agar plates |
| RAW 264.7 macrophage cell line (Tib47) | ATCC, Manassas, VA | ATCC TIB-71 | |
| Slides | VWR, Radnor, PA | 16004-422 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5761 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T8154 | |
| Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (confocal microscope) | Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY | 4109001865956000 |
Referências
- Walters, M. N., Papadimitriou, J. M. Phagocytosis: a review. CRC Critical Reviews in Toxicology. 5 (4), 377-421 (1978).
- Metschnikoff, E. Untersuchurgen uber die intracellulare Verdauung, bei wirbellosen Thieren. Arbeiten aus dem Zoologischen Instituten der Universität Wien. 5, 144 (1883).
- Tauber, A. I. Metchnikoff and the phagocytosis theory. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (11), 897-901 (2003).
- Janeway, C. A. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. Immunology Today. 13 (1), 11-16 (1992).
- Kumagai, Y., Akira, S. Identification and functions of pattern-recognition receptors. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (5), 985-992 (2010).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annual Review of Pathology. 7, 61-98 (2012).
- Candela, T., Fouet, A. Poly-gamma-glutamate in bacteria. Molecular Microbiology. 60 (5), 1091-1098 (2006).
- Kocianova, S., et al. Key role of poly-gamma-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis. Journal of Clinical Investigation. 115 (3), 688-694 (2005).
- Rothbard, S. Protective effect of hyaluronidase and type-specific anti-M serum on experimental group A Streptococcus infection in mice. Journal of Experimental Medicine. 88 (3), 325-342 (1948).
- Oh, S. Y., Budzik, J. M., Garufi, G., Schneewind, O. Two capsular polysaccharides enable Bacillus cereus G9241 to cause anthrax-like disease. Molecular Microbiology. 80 (2), 455-470 (2011).
- Knuf, M., Kowalzik, F., Kieninger, D. Comparative effects of carrier proteins on vaccine-induced immune response. Vaccine. 29 (31), 4881-4890 (2011).
- Wang, T. T., Lucas, A. H. The capsule of Bacillus anthracis behaves as a thymus-independent type 2 antigen. Infection & Immunity. 72 (9), 5460-5463 (2004).
- Vogel, L., et al. Quantitative flow cytometric analysis of opsonophagocytosis and killing of nonencapsulated Haemophilus influenzae by human polymorphonuclear leukocytes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 1 (4), 394-400 (1994).
- Salehi, S., Hohn, C. M., Penfound, T. A., Dale, J. B. Development of an Opsonophagocytic Killing Assay Using HL-60 Cells for Detection of Functional Antibodies against Streptococcus pyogenes. mSphere. 3 (6), 00617-00618 (2018).
- Wang, Y., et al. Novel Immunoprotective Proteins of Streptococcus pneumoniae Identified by Opsonophagocytosis Killing Screen. Infection & Immunity. 86 (9), (2018).
- Humphries, H. E., et al. Seroprevalence of Antibody-Mediated, Complement-Dependent Opsonophagocytic Activity against Neisseria meningitidis Serogroup B in England. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (5), 503-509 (2015).
- Jansen, W. T., et al. Use of highly encapsulated Streptococcus pneumoniae strains in a flow-cytometric assay for assessment of the phagocytic capacity of serotype-specific antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 5 (5), 703-710 (1998).
- Wang, T. T., Fellows, P. F., Leighton, T. J., Lucas, A. H. Induction of opsonic antibodies to the gamma-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis by immunization with a synthetic peptide-carrier protein conjugate. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 40 (3), 231-237 (2004).
- Chabot, D. J., et al. Protection of rhesus macaques against inhalational anthrax with a Bacillus anthracis capsule conjugate vaccine. Vaccine. 34 (34), 4012-4016 (2016).
- Chabot, D. J., et al. Efficacy of a capsule conjugate vaccine against inhalational anthrax in rabbits and monkeys. Vaccine. 30 (5), 846-852 (2012).
- Chua, J., et al. Formaldehyde and Glutaraldehyde Inactivation of Bacterial Tier 1 Select Agents in Tissues. Emerging Infectious Diseases. 25 (5), 919-926 (2019).
- . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Eighth Edition) Available from: https://grants.nih.gov/grants/olaw/guide-for-the-care-and-use-of-laboratory-animals.pdf (2011)
- Durando, P., et al. Experience with pneumococcal polysaccharide conjugate vaccine (conjugated to CRM197 carrier protein) in children and adults. Clinical Microbiology and Infection. 19, 1-9 (2013).
- Adams, W. G., et al. Decline of childhood Haemophilus influenzae type b (Hib) disease in the Hib vaccine era. JAMA. 269 (2), 221-226 (1993).
- Balmer, P., Borrow, R., Miller, E. Impact of meningococcal C conjugate vaccine in the UK. Journal of Medical Microbiology. 51 (9), 717-722 (2002).
- Chen, M., et al. Induction of opsonophagocytic killing activity with pneumococcal conjugate vaccine in human immunodeficiency virus-infected Ugandan adults. Vaccine. 26 (38), 4962-4968 (2008).
- Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (146), e59400 (2019).
- Ezzell, J. W., Welkos, S. L. The capsule of Bacillus anthracis, a review. Journal of Applied Microbiology. 87 (2), 250 (1999).
- Hanna, P. C., Acosta, D., Collier, R. J. On the role of macrophages in anthrax. Proceedings of the National Academies of Sciences of the United States of America. 90 (21), 10198-10201 (1993).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Chua, J., Deretic, V. Mycobacterium tuberculosis reprograms waves of phosphatidylinositol 3-phosphate on phagosomal organelles. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36982-36992 (2004).
- Chua, J., et al. pH Alkalinization by Chloroquine Suppresses Pathogenic Burkholderia Type 6 Secretion System 1 and Multinucleated Giant Cells. Infection & Immunity. 85 (1), (2017).
- Ober, R. J., Radu, C. G., Ghetie, V., Ward, E. S. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies. International Immunology. 13 (12), 1551-1559 (2001).
- Sorman, A., Zhang, L., Ding, Z., Heyman, B. How antibodies use complement to regulate antibody responses. Molecular Immunology. 61 (2), 79-88 (2014).
- Henckaerts, I., Durant, N., De Grave, D., Schuerman, L., Poolman, J. Validation of a routine opsonophagocytosis assay to predict invasive pneumococcal disease efficacy of conjugate vaccine in children. Vaccine. 25 (13), 2518-2527 (2007).
- Wolf, J. J. . Special Considerations for the Nonclinical Safety Assessment of Vaccines. , 243-255 (2013).
