Un metodo di screening per l'identificazione di farmaci che promuovono l'eterocromatina utilizzando la drosophila
Summary
La drosophila è un modello sperimentale ampiamente utilizzato adatto per lo screening di farmaci con potenziali applicazioni per la terapia del cancro. Qui, descriviamo l’uso di fenotipi di colore degli occhi variati della Drosophila come metodo per lo screening di composti di piccole molecole che promuovono la formazione di eterocromatina.
Abstract
La drosophila è un organismo modello eccellente che può essere utilizzato per vagliare composti che potrebbero essere utili per la terapia del cancro. Il metodo qui descritto è un metodo in vivo conveniente per identificare composti che promuovono l’eterocromatina utilizzando la Drosophila. Ceppo DX1 della Drosophila, con un fenotipo di colore degli occhi variegato che riflette le estensioni della formazione di etecromatina, fornendo così uno strumento per uno schermo farmaco che promuove l’eteocromatina. In questo metodo di screening, la varianza degli occhi viene quantificata in base alla superficie della pigmentazione rossa che occupa parti dell’occhio e viene valutata su una scala da 1 a 5. Il metodo di screening è semplice e sensibile e consente di testare composti in vivo. Lo screening farmacologico con questo metodo fornisce un modo rapido ed economico per identificare farmaci che promuovono l’eteocromatina che potrebbero avere effetti benefici nelle terapie contro il cancro. Identificare composti che promuovono la formazione di eteocromatica potrebbe anche portare alla scoperta di meccanismi epigenetici dello sviluppo del cancro.
Introduction
L’eterocromatina è una forma condensata di DNA che svolge un ruolo centrale nell’espressione genica, nella regolazione della segregazione cromosomica durante la divisione cellulare e nella protezione contro l’instabilità delgenoma 1. L’eterocromatina è stata considerata un regolatore di repressione genica e per proteggere l’integrità cromosomica durante la mitosi cellulare2,3. È associato con la di- e tri-metilazione di istone H3 lisina 9 (H3K9me) durante l’impegno di lignaggio4,5. Inoltre, il reclutamento di proteine del cromodominio Heterochromatin Protein 1 (HP1) è anche considerato associato all’eterocromatica e alla repressione epigenetica dell’espressione genica6. Queste proteine sono componenti essenziali e marcatori della formazione di eterocromatica.
Poiché l’instabilità genomica consente alle cellule di acquisire alterazioni genetiche che promuovono la carcinogenesi, l’eterocromatina sta diventando sempre più riconosciuta nello sviluppo del cancro e può essere mirata per il trattamento del cancro7,8. Attualmente, non ci sono farmaci che sono ben consolidati nell’assistere la formazione di eterocromatina. Qui, presentiamo un metodo semplice e veloce ma efficiente per lo screening di composti di piccole molecole che promuovono la formazione di eterocromatina. Lo screening viene fatto trattando la Drosophila con una libreria di farmaci di piccole molecole. Questo metodo sfrutta un fenotipo del colore degli occhi variegato nel ceppodi Drosophila DX1che è influenzato dai livelli di eteromatina. Le mosche DX1 contengono una matrice di tandem di sette transgenie P[lac-w], che hanno l’espressione/depressione variegata a seconda dell’eteocromaticizzazione, quindi, l’entità della varietà nel colore degli occhi riflette il livello di eteocromatica. In particolare, l’aumento dell’eteocromatica potrebbe essere rilevato dall’aumento della proporzione di colore degli occhi variegato (occhio bianco). Al contrario, la diminuzione dell’eterocromatina sarebbe rilevata dall’aumento della proporzione dell’espressione transgenica P[lac-w] (occhio rosso)9,10,11,12.
Pertanto, approfittiamo di questo sistema transgene di Drosophila che produce un fenotipo del colore degli occhi variegato poiché la sua espressione è direttamente correlata alla quantità di etecromatina presente. Dopo la scoperta di composti che sono sospettati di promuovere la formazione di etecromatina, possiamo confermare questo sospetto utilizzando altri metodi come macchia occidentale. Queste sostanze che promuovono l’eteocromatina possono essere ulteriormente sviluppate per gli studi clinici in pazienti in futuro.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’eteocromatica è una forma condensata di DNA che svolge un ruolo centrale nella regolazione dell’espressione genica. Sta diventando sempre più riconosciuto nel cancro e può servire come potenziale bersaglio per la terapia del cancro15,16,17,18. Composti di piccole molecole sono comunemente utilizzati nello sviluppo di farmaci a causa di vantaggi nella produzione, conservazione, e metabolism…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo J. Birchler, E. Bach e il Bloomington Drosophila Stock Center per vari ceppi di Drosophila; il Programma di Terapia Di Sviluppo del National Cancer Institute (NCI) per la libreria di farmaci per piccole molecole del Set di Oncologia; Studenti universitari UCSD tra cui Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza e Alex Chavez. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta da una sovvenzione di ricerca dalla American Thoracic Society a J.L. e dai finanziamenti da NIH: R01GM131044 a W.X.L.
Materials
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
Referências
- Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
- Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
- Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Pesquisa do Câncer. 78 (10), 2691-2704 (2018).
- Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
- Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
- Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
- Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
- Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
- Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genética. 159 (4), 1631-1642 (2001).
- Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
- Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
- Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
- Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
- Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).
