Een screeningmethode voor de identificatie van heterochromatine-bevorderende drugs met drosophila
Summary
Drosophila is een veel gebruikt experimenteel model geschikt voor het screenen van geneesmiddelen met mogelijke toepassingen voor kankertherapie. Hier beschrijven we het gebruik van Drosophila bonte oogkleurfenotypes als een methode voor het screenen van kleine moleculen verbindingen die heterochromatinevorming bevorderen.
Abstract
Drosophila is een uitstekend model organisme dat kan worden gebruikt om verbindingen die nuttig kunnen zijn voor kankertherapie scherm. De hier beschreven methode is een kosteneffectieve in vivo methode om heterochromatine-bevorderende verbindingen te identificeren met behulp van Drosophila. De Drosophila’s DX1 stam, met een bonte oogkleur fenotype dat de omvang van heterochromatine vorming weerspiegelt, waardoor een hulpmiddel voor een heterochromatine-bevorderend drugscherm. Bij deze screeningmethode wordt oogvariatie gekwantificeerd op basis van het oppervlak van rode pigmentatie dat delen van het oog beslaat en wordt beoordeeld op een schaal van 1 tot 5. De screeningmethode is eenvoudig en gevoelig en maakt het mogelijk om verbindingen in vivo te testen. Drug screening met behulp van deze methode biedt een snelle en goedkope manier voor het identificeren van heterochromatine-bevorderende geneesmiddelen die gunstige effecten kunnen hebben in kanker therapieën. Het identificeren van verbindingen die de vorming van heterochromatine bevorderen, kan ook leiden tot de ontdekking van epigenetische mechanismen voor de ontwikkeling van kanker.
Introduction
Heterochromatine is een verkorte vorm van DNA die een centrale rol speelt bij genexpressie, bij het reguleren van chromosoomsegregatie tijdens celdeling en bij de bescherming tegen genoominstabiliteit1. Heterochromatine wordt beschouwd als een genrepressieregulator en ter bescherming van de chromosoomintegriteit tijdens celmitose2,3. Het wordt geassocieerd met de di- en tri-methylatie van histon H3 lysine 9 (H3K9me) tijdens afstamming strekkende verplichting 4,5. Bovendien wordt de aanwerving van Chroom-1-eiwitten (Heterochromatine 1) ook beschouwd als geassocieerd met heterochromatine en epigenetische onderdrukking van genexpressie6. Deze eiwitten zijn essentiële componenten en markers van heterochromatinevorming.
Aangezien genomische instabiliteit cellen in staat stelt genetische veranderingen te verwerven die carcinogenese bevorderen, wordt heterochromatine steeds meer erkend in de ontwikkeling van kanker en kan het doelwit zijn voor kankerbehandeling7,8. Momenteel zijn er geen geneesmiddelen die goed zijn ingeburgerd in het helpen van heterochromatinevorming. Hier presenteren we een eenvoudige en snelle maar efficiënte methode voor het screenen van kleine moleculen verbindingen die heterochromatinevorming bevorderen. De screening wordt gedaan door Drosophila te behandelen met een bibliotheek van kleine moleculen. Deze methode maakt gebruik van een bonte oogkleur fenotype in de DX1Drosophila stam die wordt beïnvloed door heterochromatine niveaus. DX1 vliegen bevatten een tandem array van zeven P [lac-w] transgenes, die de bonte expressie / depressie, afhankelijk van heterochromatinisatie, daarom, de omvang van de variëteit in de oogkleur weerspiegelen de heterochromatine niveau. Specifiek, toenemende heterochromatine kan worden gedetecteerd door het stijgende aandeel van bonte oogkleur (wit oog). Integendeel, afnemende heterochromatine zou worden gedetecteerd door het stijgende aandeel van de P[lac-w] transgene expressie (rode ogen)9,10,11,12.
Daarom maken we gebruik van dit Drosophila transgene systeem dat een bonte oogkleur fenotype produceert, omdat de expressie direct gecorreleerd is aan de hoeveelheid heterochromatine aanwezig. Bij ontdekking van verbindingen die worden verdacht van het bevorderen van heterochromatine vorming, kunnen we bevestigen dit vermoeden met behulp van andere methoden, zoals westerse vlek. Deze heterochromatine-bevorderende stoffen kunnen in de toekomst verder worden ontwikkeld voor klinische studies bij patiënten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Heterochromatine is een verkorte vorm van DNA die een centrale rol speelt bij het reguleren van genexpressie. Het wordt steeds meer erkend bij kanker en kan dienen als een potentieel doelwit voor kankertherapie15,16,17,18. Kleine moleculen verbindingen worden vaak gebruikt in de ontwikkeling van geneesmiddelen als gevolg van voordelen in de productie, behoud, en metabolisme in menselijke licham…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken J. Birchler, E. Bach en het Bloomington Drosophila Stock Center voor diverse Drosophila stammen; het National Cancer Institute (NCI) Developmental Therapeutics Program for the Oncology Set small-molecule drug library; UCSD studenten waaronder Amy Chang, Taesik You, Jessica Singh-Banga, Rachel Meza, en Alex Chavez. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van american Thoracic Society aan J.L. en financiering van NIH: R01GM131044 aan W.X.L.
Materials
| Drosophila | DX1 strain | DX1 flies were kindly provided by James Birchler (University of Missouri) | |
| Drosophila food media | UCSD fly kitchen | ||
| Methotrexate | NCI drug library | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Ethyl alcohol | Sigma | E7023-500ML |
Referências
- Morgan, M. A., Shilatifard, A. Chromatin signatures of cancer. Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).
- Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals. Epigenetics Chromatin. 8, 3 (2015).
- Allshire, R. C., Madhani, H. D. Ten principles of heterochromatin formation and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).
- Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
- Grewal, S. I., Moazed, D. Heterochromatin and epigenetic control of gene expression. Science. 301 (5634), 798-802 (2003).
- Heard, E. Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome. Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).
- Ci, X., et al. Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer. Pesquisa do Câncer. 78 (10), 2691-2704 (2018).
- Zhu, Q., et al. Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer. Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).
- Dorer, D. R., Henikoff, S. Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila. Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).
- Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays. Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).
- Shi, S., et al. JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing. Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).
- Shi, S., et al. Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability. Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).
- Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes. Genética. 159 (4), 1631-1642 (2001).
- Loyola, A. C., et al. Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug. Scientific Reports. 9 (1), 11673 (2019).
- Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression. Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).
- Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. Heterochromatin: Guardian of the Genome. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).
- Zhu, Q., et al. BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing. Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).
- Hu, X., et al. Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).
