A Rabbit Venous Interposition Model Mimicking Revascularization Surgery using Vein Grafts to Assess Intimal Hyperplasia under Arteriellen Blutdruck

Summary

Das vorliegende Protokoll zielt darauf ab, experimentell venöse Intimhyperplasie zu erzeugen, indem Venen arteriellen Blutdruck für die Entwicklung von Strategien zur Abschwächung venöser Intimhyperplasie nach Revaskularisationsoperationen mit Venentransplantaten ausgesetzt werden.

Abstract

Obwohl Venentransplantate häufig als autologe Transplantate bei Revaskularisationsoperationen bei ischämischen Erkrankungen verwendet wurden, bleibt die langfristige Durchgängigkeit aufgrund der Beschleunigung der intimalen Hyperplasie aufgrund der Exposition gegenüber arteriellem Blutdruck schlecht. Das vorliegende Protokoll ist für die Etablierung einer experimentellen venösen Intimhyperplasie konzipiert, indem Kaninchenjugularvenen in die ipsilateralen Karotisarterien eingebracht werden. Das Protokoll erfordert keine chirurgischen Eingriffe tief im Körperstamm und das Ausmaß des Schnittes ist begrenzt, was für die Tiere weniger invasiv ist, was eine Langzeitbeobachtung nach der Implantation ermöglicht. Dieses einfache Verfahren ermöglicht es Forschern, Strategien zu untersuchen, um das Fortschreiten der intimalen Hyperplasie der implantierten Venentransplantate abzumildern. Mit diesem Protokoll berichteten wir die Effekte Transduktion von microRNA-145 (miR-145), die bekannt ist, um den Phänotyp der vaskulären glatten Muskelzellen (VSMCs) von der proliferativen in den kontraktilen Zustand, in geerntete Venentransplantate zu kontrollieren. Wir bestätigten die Dämpfung der intimalen Hyperplasie von Venentransplantaten durch die Transducing miR-145 vor der Implantationsoperation durch die Phänotypänderung der VSMCs. Hier berichten wir über eine weniger invasive experimentelle Plattform, um die Strategien zu untersuchen, die verwendet werden können, um die intimale Hyperplasie von Venentransplantaten in Revaskularisationsoperationen zu dämpfen.

Introduction

Die Zahl der Patienten, die aufgrund von Arteriosklerose an ischämischen Erkrankungen leiden, steigt weltweit^{um 1}. Trotz der aktuellen Fortschritte in medizinischen und chirurgischen Therapien für Herz-Kreislauf-Erkrankungen, ischämische Herzerkrankungen, wie Myokardinfarkt, bleiben eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität². Darüber hinaus induziert periphere arterielle Erkrankungen, die durch einen verminderten Blutfluss zu den Gliedmaßen gekennzeichnet sind, eine kritische Gliedmaßen-Ischämie, wobei etwa 40% der Patienten ihre Beine innerhalb von 6 Monaten nach der Diagnose verlieren und die Sterblichkeitsrate bis zu 20%³beträgt.

Revaskularisationsoperationen, wie koronare Bypass-Transplantation (CABG) und Bypass-Chirurgie für periphere Arterien, sind wichtige therapeutische Optionen für ischämische Erkrankungen. Der Zweck dieser Operationen ist es, einen neuen Blutweg zur Verfügung zu stellen, um ausreichend Blutfluss in Richtung der distalen Stelle der stenotischen oder okklutischen Läsionen der atherosklerotischen Arterien zur Verfügung zu stellen. Obwohl in situ arterielle Transplantate, wie interne Brustarterien für CABG, aufgrund der erwarteten längeren Durchgängigkeit als Bypasstransplantate bevorzugt werden, werden Venentransplantate, wie autologe saphenous Venen, aufgrund der höheren Zugänglichkeit und Verfügbarkeit häufig verwendet⁴. Der Schwachpunkt der Venentransplantate ist die schlechte Durchgängigkeitsrate im Vergleich zu arteriellen Transplantaten⁵ aufgrund einer beschleunigten Intimhyperplasie, wenn sie arteriellem Druck ausgesetzt ist, was zu einer Venentransplantaterkrankung führt⁶.

Venentransplantat-Krankheit entwickelt sich durch die folgenden drei Schritte: 1) Thrombose; 2) intimale Hyperplasie; und 3) Arteriosklerose⁷. Um die Venentransplantatskrankheit zu bekämpfen, wurde eine Menge Grundlagenforschung durchgeführt⁸. Bisher wird keine andere pharmakologische Strategie als thrombozyslösende und lipidsenkende Therapien zur sekundären Prävention nach koronaren oder peripheren Revaskularisationsoperationen in den jüngsten Richtlinien^9,10,11,12empfohlen. Um die Venentransplantatskrankheit, insbesondere die intimale Hyperplasie, zu überwinden, ist daher die Einrichtung einer relevanten experimentellen Plattform für weitere Studien erforderlich.

Intimhyperplasie ist ein adaptives Phänomen, das als Reaktion auf die Veränderung in der Umgebung auftritt, wo vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) sich vermehren, akkumulieren und extrazelluläre Matrix in der Intima erzeugen. Folglich stellt es eine Grundlage für Transplantatatherom⁷dar. In der hyperplastischen Intima, VSMCs tragen Proliferation, und Produktion statt Kontraktion, genannt “phänotypische Veränderung”⁸. Es ist ein wichtiges Forschungsziel, um den Phänotyp der VSMCs der Venentransplantate zu kontrollieren, um Venentransplantat-Krankheit zu verhindern, und zahlreiche grundlegende Studien wurden zu diesem^Thema8 durchgeführt. Jedoch, eine randomisierte kontrollierte klinische Studie, die darauf abzielte, pharmakologische Kontrolle des VSMC-Phänotyps zu erreichen, zeigte begrenzte Ergebnisse¹³. Darüber hinaus gibt es keine standardisierten Therapien, um intimale Hyperplasie zu verhindern. Weitere Grundlagenforschung, einschließlich Tiermodellstudien, ist notwendig.

Um die Forschung auf diesem Gebiet zu fördern, ist es entscheidend, ein Tiermodell zu etablieren, das Venentransplantate unter arteriellem Blutdruck rekapituliert und eine langfristige, postoperative Beobachtung ermöglicht. Carrel et al. erstellten ein Canine-Modell der Implantation der äußeren Jugularvene in die Halsschlagader¹⁴. Danach wurden eine Vielzahl von Venentransplantaten eingesetzt, um die physiologischen und pathologischen Wirkungen von Veränderungen des arteriellen Blutdrucks zu untersuchen, einschließlich der unteren Venenhöhle, die in die Brust- oder Bauchaorta eingepfropft wurde, oder die in die Femoralarterie^15,,16,,17eingepfropfte Saphenovene. Diese Modelle wurden in größeren Tieren wie Schweinen oder Hunden gebaut, die für die Nachahmung einer Venentransplantatkrankheit in einem klinischen Fall geeignet sind. Die Etablierung eines Tiermodells, das ohne spezielle chirurgische Techniken und zu geringeren Kosten hergestellt werden kann, wäre jedoch ideal für Forscher, die versuchen, eine neue therapeutische Strategie zur Abschwächung der intimalen Hyperplasie durch VSMC-Phänotypkontrolle in vivo zu entwickeln. Zunächst wurde die Einlagerung der Jugularvene in die Halsschlagader bei einem Kaninchen im Bereich der Neurochirurgie^18,19eingeführt. Danach wurde es auf die Forschung über intimale Hyperplasie^{angewendet 20,21}. Das ursprüngliche Modell besteht allein aus venöser Interposition, was Zeit spart. Darüber hinaus zeigte eine nachfolgende Studie, dass die Präparation eines Venentransplantats auch die intimale Hyperplasie^{beeinflusste 22}. Davies et al. bewerteten die Wirkung einer Ballonkatheterverletzung auf die intimale Hyperplasie in einem Kaninchen venous Interposition Modell^23,24. Obwohl ballonkatheterverletzungen zusätzlich zur Venenverzinposition für eine klinische Umgebung relevanter waren, war auch ein reproduzierbareres Modell wünschenswert. So untersuchten Jiang et al. die Auswirkungen von Differentialflussumgebungen auf die intimale Hyperplasie und etablierten ein distales Zweigligationsverfahren als reproduzierbares Modell²⁵. Allerdings verwendeten sie eine Manschettentechnik zum Zeitpunkt der Venentransplantat-Interposition, die sich von handgenähter Anastomose im klinischen Umfeld unterscheidet. Im vorliegenden Protokoll berichten wir über ein reproduzierbares, klinisch relevantes und breit verfügbares Verfahren zur Herstellung eines venösen Mischpositionsmodells für Kaninchen zur Beurteilung der intimalen Hyperplasie unter arteriellem Blutdruck.

Protocol

HINWEIS: Alle chirurgischen Eingriffe an Tieren sollten in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (www.nap.edu/catalog/5140.html) oder anderen geeigneten ethischen Richtlinien durchgeführt werden. Die Protokolle sollten vom Tierschutzausschuss der zuständigen Institution genehmigt werden, bevor sie fortfahren. 1. Zubereitung von Tieren Kaufen Sie männliche japanische weiße Kaninchen (oder Kaninchen mit entsprechender Körpergröße) mit …

Representative Results

Abbildung 1A zeigt ein repräsentatives Bild der erfolgreichen intimalen Hyperplasie nach 2 Wochen nach venöser Interpositionsoperation (Obere Platte). Das untere Panel zeigt die therapeutischen Wirkungen von microRNA-145-geladenen Poly-Nanopartikeln (Milch-Co-Glykolsäure), die die intime Hyperplasie (unteres Panel) dämmen. Abbildung 1B zeigt den Vergleich der intimalen Hyperplasie zwischen der Kontrollgruppe mit Phosphatgepufferten Kochsaline-Kontrollgruppen…

Discussion

Das vorliegende Protokoll soll eine experimentelle Plattform bieten, um verschiedene molekulare oder genetische Interventionen für VSMCs zu testen, um den Phänotyp vom proliferativen zum kontraktilen Zustand zu kontrollieren und anschließend das Fortschreiten der venösen intimen Hyperplasie in vivo zu dämpfen. Mit diesem Modell haben wir die intimale Hyperplasie 2 Wochen nach der Operation erfolgreich vorbereitet (Abbildung 1A) und das therapeutische Potenzial von microRNA-145 zur Kontr…

Materials

10% Povidone-iodine solution	Nakakita	872612	Surgical expendables
2-0 VICRYL Plus	Johnson and Johnson	VCP316H	Surgical expendables
4-0 Silk suture	Alfresa pharma	GA04SB	Surgical expendables
8-0 polypropylene suture	Ethicon	8741H	Surgical expendables
Cefazorin sodium	Nichi-Iko Pharmaceutical	6132401D3196	Antibiotics
Fogarty Catheter (2Fr)	Edwards Lifesciences LLC	E-060-2F	Surgical expendables
Heparin	Nipro	873334	Anticoagulant
Intravenous catheter (20G)	Terumo	SR-OT2051C	Surgical expendables
Isoflurane	Fujifilm	095-06573	Anesthesia
Lidocaine hydrochloride	MP Biomedicals	193917	Anesthesia
Pentobarbital sodium	Tokyo Chemical Industry	P0776	Anesthesia