本研究の目的は、心筋細胞を成体から再現的に単離し、DNAの含有量と核形成を測定する方法を開発することです。
成人哺乳類の心臓は、心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞を含む様々な細胞タイプで構成される。組織学的セクション上の心筋細胞の核を確実に同定することは困難であるため、多くのグループは、免疫染色を行うために固定前に生存可能な心筋細胞を単離することに依存しています。しかし、これらの生きた心筋細胞分離技術は、最大の最適化にもかかわらずサンプルからサンプルまでの固有の変動を伴い、サンプルの収量、生存率、品質を最大化するための最適化を必要とします。ここでは、個々の心筋細胞の生体内形態を維持しながら最大収量をもたらす心臓の酵素消化前の固定を含む再現性プロトコルを報告する。さらに、個々の心筋細胞の核およびDNA含有量を決定する自動分析プラットフォームを開発しました。胸腔を露出させた後、心臓はPBSで60mM KClで灌流することによって拡張期に逮捕された。次に、心臓を4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に固定し、次いで60mg/mLコラゲナーゼ溶液で消化した。消化後、細胞をトリチュレーションによって単発化し、心筋細胞画分を差動遠心によって濃縮した。孤立した心筋細胞は、得られた集団の純度を評価するためにトロポニンTおよびαアクチニンのために染色された。さらに、DAPI染色後の心筋細胞核形成とプロイディ状態を決定する画像解析プラットフォームを開発しました。画像ベースの策略評価により、一貫した再現性のある結果が得られました。このように、このプロトコルを用いて、個々の心筋細胞の天然型を保存し、最大収量を達成しながら免疫細胞化学およびDNA含有量分析を可能にすることができる。
心臓病は、何十年もの間、西側諸国の大多数で主要な死因となっています1,,2.心血管疾患の治療における多くの改善は生存率を改善しているが、現在、失われた心筋細胞に代わる治療法はない。したがって、心筋細胞機能、増殖、アポトーシスおよび肥大に関する研究は、科学界の主要な焦点であり続けている。成人哺乳類の心臓は再生能力が非常に限られているため、心筋細胞の再生率は年間1%未満と推定され、心筋細胞増殖事象を確実に同定することが極めて重要である3,4。4増殖事象を測定するほとんどの戦略は、以前または現在の増殖を評価するために組み込まれたDNAヌクレオチド類似体の染色、または活性増殖の核マーカーの染色のいずれかに依存する。増殖性心筋細胞の総数が,3,6と非常に少ないため、心筋細胞増殖事象を確実に同定することが特に重要3である。例えば、1%の内因性心筋細胞の1%の更新率に基づいて、1つは、成人マウス心臓77、88において任意の時点で25〜50の心筋細胞が増殖することを見つけることが期待できる。心筋細胞核の同定に不正確な場合は、偽陽性の結果をもたらす可能性があります。したがって、組織学的セクション9から困難で信頼性が低いことが証明されている心筋細胞核を確実に同定することが重要である。心筋細胞の同定は、αアクチニンなどのマーカーを用いても他の細胞型から心筋細胞を区別することは難しいかもしれないので、組織切片からよりもはるかに正確であるが、PCM1は組織学的セクション10における心筋細胞核の信頼できるマーカーであるかもしれない。
現在のプロトコルは、固定前に生きた心筋細胞を単離することに依存しており、これは心筋細胞の少なくとも30%の死を引き起こすことが知られており、心筋細胞11の特定の集団の不注意な選択につながる可能性がある。さらに、これらのプロトコルは、再現性のある結果を提供するために最適化することが困難で有名です。最適化された分離技術でさえ、通常、生きている、様々な収量を持つ棒状の心筋細胞を65%以下に生み出すことができる12.
これらの問題を克服するために、研究者が固定心筋細胞を分離できるプロトコルを開発しました。試料は分離前に固定されるため、収率は最大化され、生体内形態は十分に保存されます。さらに、このプロトコルを使用すると、臨床サンプルから心筋細胞を分離することが可能であり、これは通常、調達直後に固定される。さらに、新たに生成された心筋細胞を同定するためには、個々の心筋細胞の核形成およびプロイド状態を測定することが重要であり、二量心筋細胞のみが典型的には新たに形成されると仮定される。フローサイトメトリーは多核化と多重性を区別できず、比較的時間とリソースを消費するプロトコルです。画像内の核の手動のアウトラインと測定は、非常に低いスループットであり、人間の偏見を起こしやすいです。固定された、分離されたDAPI染色型心筋細胞の画像の自動定量化は、これらの問題の両方を解決します。核生成およびプロイド分布のイメージングベースの定量は、基本的な装置を用いた最低時間と試薬で得ることができます。
心筋細胞は培養で維持することができないので、そのアーキテクチャと機能11を研究できるように原発性心筋細胞を分離することが重要である。したがって、心筋細胞の分離技術は、心臓フィールドで広く使用されています。目標が心筋細胞の機能的側面を決定することであるならば、実行可能な心筋細胞を分離することが重要である。これらの生きた心筋細胞はまた、単離された心筋細胞に対する免疫染色を行うために使用することができる。しかし、生きた心筋細胞を単離する技術を最適化することは技術的には困難であり、最良の技術でさえ、通常は60〜65%の生きた棒状心筋細胞しか得られ、残りの心筋細胞はすべてボールアップして死んでいるか死んでいるか11,12,12である。ここでは、研究者が最初に心臓を固定し、心筋細胞を効率的に分離できる技術を開発しました。この新しいプロトコルは、以前に公開されたプロトコルと比較して、棒状の心筋細胞のはるかに高い収率を可能にします。さらに、核形成とプロイドに基づいて心筋細胞を自動的に分類するイメージング解析プラットフォームを開発しました。これらの新しい方法論により、グループは異なるタンパク質の心筋細胞を染色し、心臓の再生可能性のサロゲートとして心筋細胞の精始および核形成状態を研究することができる。
ここで説明するプロトコルは比較的簡単で、高度な機器なしで実行できます。消化のためのコラゲナーゼの量とインキュベーション時間は、コラゲナーゼロットとそれを提供する会社によって異なる場合があります。コネラゲーゼ2型は、生きた心筋細胞を得るための心臓を消化するのに最も広く用いられているため、2型を用いた。我々の観察に基づいて、我々は線維化のレベルに関係なく、60mg/mLコラゲナーゼタイプ2での夜間インキュベーションがほぼすべてのマウス心臓に最適であると判断した。細胞内タンパク質は固定されており、細胞外コラーゲンほどアクセスできないので、消化過剰の問題は一度もありませんでした。しかし、心臓が適切に消化されない場合、より活発なトリチュレーションが必要になる可能性があり、せん断応力による細胞の断片化を引き起こす。したがって、トリアーレーションに進む前に心臓が適切に消化されていることを確認することが重要です。心臓の硬さは、消化の程度を評価するために鉗子で絞ることによってテストすることができる。コラゲナーゼによるインキュベーションに続いて、心臓は硬くなく、引き裂きやすいはずです。他のタイプのコラゲザーゼも使用できる。以前のレポートでは、コラベナーゼBとD14の組み合わせを使用しました。
さらに、このプロトコルは、心臓15の心筋細胞の総数を評価するために使用できると考えています。しかし、心臓から全ての心筋細胞を得て定量することが目標である場合、コラゲターゼ溶液中で長期間(例えば、3~7日間)、コラゲターゼ溶液を1日1回補充することが重要です。これは、心筋細胞の収量に対するトリウレーションの程度の影響を排除することにより、分離効率の不整合を最小限に抑えます。
DNA含有量を使用して策略を測定することは新しいものではなく、何十年もの間、フローサイトメトリーで使用されてきました。近年、顕微鏡検査を用い、核16あたりのDNA含有量を推定することが同様に可能であることが示された。ここでは、新たに形成された心筋細胞の代理として、心筋細胞核のプロイドを測定するためにこの戦略を実施した。心臓再生の分野における独断は、単核化されたジプロイド心筋細胞のみがサイトカネシスを受け、新しい心筋細胞を生じさせることができるということです。生体内での新しい心筋細胞形成を測定することは非常に困難であるため、DNAヌクレオチドアナログの投与後に追い込まれた心筋細胞を単離し、単核化のレベルを決定し、新しい心筋細胞を生成する心臓の能力の近似として使用されてきた。ここでは、心筋細胞のプロイドを容易に定量化できるImageJのマクロを提供する。G1ピークの位置を正確に推定するには、最低でも500個の核を測定する必要があります。染色および画像化条件が画像プレートの全ウェルにわたって一貫していることを確認するために注意が払われる場合、サンプル全体で500個の核のみを画像化する必要があり、そうでなければ、画像群18、19,19あたり500個の核が必要である。核化とプロイドのイメージングベースの測定の制限は、2次元画像を使用する場合、実際の心筋細胞核から核と接着細胞を区別することが困難である。このような付着細胞は、多核細胞の量を過大評価し、四肢位心筋細胞核集団の測定の精度を低下させる可能性がある。この問題を解決するための1つの可能な戦略は、心筋細胞核マーカーPCM166、2020を使用することです。しかし、適切に固定された細胞や組織に対して信頼性の高いPCM1染色を得ることは困難でした。
もう一つの潜在的な制限は、一部の核染色画像が重要なバックグラウンド細胞質染色を有し、広範な前処理なしでフィジーの組み込みの方法を使用して適切な閾値を防ぐことである。さらに、このバックグラウンド蛍光の予測値への不規則な寄与は、その精度を低下させる。また、細胞がDNA染色液に十分な時間放置されない場合、蛍光色素は核内の飽和に結合せず、核積分強度とDNA含有量の線形関係の仮定は正確ではなくなります。
ソフトウェアは心筋細胞クラスターをセグメント化できず、代わりに分析からそれらを除去する点に留意すべきである。したがって、比較的低密度(例えば、1000細胞/cm2)で心筋細胞を播種することが極めて重要である。さらに、ソフトウェアは、エンドツーエンドと長い、特異な心筋細胞を並べた2つの心筋細胞を区別することはできません。このようなクラスターは、誤って多核化推定を膨らませる可能性があります。
上記の方法では生存可能な心筋細胞を得ることができず、動的細胞プロセスの測定には使用できませんが、免疫染色を行うことが目的であれば、上記の方法は、心筋細胞の収率が高く、形態およびタンパク質局在化の面でより良い品質を有する既存のプロトコルよりも優れていると考えています。最後に、説明した方法は、臨床サンプル14、21,21から心筋細胞を単離するために使用することができる。私たちは、記載された方法論は、異なる研究者が高品質の心筋細胞を取得し、新しい心筋細胞形成の代理人として核形成と策略を測定するのに役立つと信じています。
The authors have nothing to disclose.
JHvBは、NIH、再生医療ミネソタ、ハートウェル財団の個別生物医学研究賞からの助成金によって支援されています。
96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
Cytation3 | BioTek | – | Used for automated imaging for DNA analysis |
DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | – | Used for analyzing images |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
Nikon A1R HD25 | Nikon | – | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
R | r-project.org | – | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |