Målet med dette arbejde er at udvikle en metode til reproducerbart isolere kardiomyocytter fra det voksne hjerte og måle DNA-indhold og kerner.
Den voksne pattedyr hjerte er sammensat af forskellige celletyper, herunder kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster. Da det er vanskeligt at pålideligt identificere kerner af kardiomyocytter på histologiske sektioner, mange grupper er afhængige af at isolere levedygtige kardiomyocytter før fiksering til at udføre immunostaining. Men disse levende kardiomyocyt isolation teknikker kræver optimering for at maksimere udbyttet, levedygtighed og kvalitet af prøverne, med iboende udsving fra prøve til prøve trods maksimal optimering. Her rapporterer vi en reproducerbar protokol, der involverer fiksering før enzymatisk fordøjelse af hjertet, hvilket fører til maksimalt udbytte og samtidig bevare in vivo morfologi af de enkelte kardiomyocytter. Vi udviklede endvidere en automatiseret analyseplatform til at bestemme antallet af kerner og DNA-indhold pr. kerne for individuelle kardiomyocytter. Efter at have afsløret brysthulen, hjertet blev arresteret i diastole af perfusion med 60 mM KCl i PBS. Dernæst blev hjertet fastsat i 4% paraformaldehyd (PFA) opløsning, og derefter fordøjet med 60 mg/ml kollagenaseopløsning. Efter fordøjelser blev cellertalt ved trituration, og kardiomyocytfraktionen blev beriget via differentialcentrifugering. Isolerede kardiomyocytter blev plettet for Troponin T og α-actinin for at vurdere renheden af den opnåede population. Desuden udviklede vi en billedanalyseplatform til bestemmelse af cardiomyocyte-kernestatus og ploidystatus efter DAPI-farvning. Billedbaserede ploidy vurderinger førte til konsekvente og reproducerbare resultater. Således, med denne protokol, er det muligt at bevare indfødte morfologi af individuelle kardiomyocytter at tillade immunoktokemi og DNA-indhold analyse samtidig opnå maksimalt udbytte.
Hjertesygdom har været den hyppigste dødsårsag i de fleste vestlige lande i mange årtier1,2. Selv om mange forbedringer i behandlingen af hjerte-kar-sygdomme har forbedret overlevelse, der er i øjeblikket ingen behandlinger, der kan erstatte tabte kardiomyocytter. Derfor har undersøgelser relateret til kardiomyocytfunktion, spredning, apoptose og hypertrofi været og er fortsat et vigtigt fokusområde for det videnskabelige samfund. Da det voksne pattedyr hjerte har en meget begrænset regenerativ kapacitet, med en anslået cardiomyocyte fornyelsesrate på mindre end 1% om året, er det afgørende vigtigt at pålideligt identificere cardiomyocyte proliferative begivenheder3,4. De fleste strategier, der måler proliferativ begivenheder er afhængige enten på farvning for indarbejdet DNA nukleotid analoger til at vurdere tidligere eller nuværende spredning, eller pletten for nukleare markører for aktiv spredning5. Det er især vigtigt at identificere kardiomyocyt proliferative hændelser, da det samlede antal proliferative kardiomyocytter er sålavt 3,6. For eksempel, baseret på en 1% fornyelse sats af endogene kardiomyocytter om året, kan man forvente at finde mellem 25 og 50 kardiomyocytter, der skal proliferative på et givet tidspunkt i den voksne mus hjerte7,8. Eventuelle unøjagtigheder i identifikationen af cardiomyocyte kerner kan føre til falske positive resultater. Derfor er det afgørende at pålideligt identificere cardiomyocyte kerner, som har vist sig vanskeligt og upålidelige fra histologiske afsnit9. Identifikation af kardiomyocytter er langt mere præcis fra enkelte celler end fra vævssektioner, da det kan være vanskeligt at skelne kardiomyocytter fra andre celletyper, selv når du bruger markører som α-actinin, selv om PCM1 kan være en pålidelig markør for cardiomyocytekerner i histologiske afsnit10.
Nuværende protokoller er afhængige af at isolere levende kardiomyocytter før fiksering, som er kendt for at forårsage død på mindst 30% af kardiomyocytter, og kan føre til utilsigtet udvælgelse af specifikke populationer af kardiomyocytes11. Desuden er disse protokoller notorisk vanskelige at optimere for at give reproducerbare resultater. Selv optimeret isolation teknikker kan typisk producere ikke mere end 65% levende, stang-formede kardiomyocytter med varierendeudbytter 12.
For at løse disse problemer, vi udviklet en protokol, der giver forskerne mulighed for at isolere faste kardiomyocytter. Da prøverne er fastsat før isolation, er udbyttet maksimeret, og in vivo morfologi er velbevaret. Desuden, med denne protokol er det muligt at isolere kardiomyocytter fra kliniske prøver, som typisk fastsættes umiddelbart efter indkøb. Endvidere, at identificere nygenererede kardiomyocytter, er det vigtigt at måle kernen og ploidy status af de enkelte kardiomyocytter, da kun diploid cardiomyocytes typisk antages at være nydannede. Flowcytometri kan ikke skelne mellem flerkerner og polyploidi og er en relativt tids- og ressourcekrævende protokol. Manuel disposition og måling af kerner i billeder er meget lav-gennemløb og tilbøjelige til menneskelige bias. Automatiseret kvantificering af billeder af faste, isolerede DAPI-farvede kardiomyocytter løser begge disse problemer. Billeddannelsesbaseret bestemmelse af nukleation og ploidyfordelinger kan opnås med et minimum af tid og reagenser ved hjælp af basisudstyr.
Da kardiomyocytter ikke kan opretholdes i kulturen, er det vigtigt at isolere primære kardiomyocytter for at kunne studere deres arkitektur og funktion11. Derfor har kardiomyocyte isolation teknikker været meget udbredt i hjertefeltet. Hvis målet er at bestemme funktionelle aspekter af kardiomyocytter, er det vigtigt at isolere levedygtige kardiomyocytter. Disse levende kardiomyocytter kan også bruges til at udføre immunstaining på isolerede kardiomyocytter. Men optimering af teknikken til at isolere levende kardiomyocytter er teknisk udfordrende, og selv de bedste teknikker typisk kun give 60-65% levende stang-formede cardiomyocytes, og de resterende kardiomyocytter er alle balled op og døende eller døde11,12. Her udviklede vi en teknik, der vil gøre det muligt for forskere først at fastsætte hjertet, og derefter isolere kardiomyocytter effektivt. Denne nye protokol giver mulighed for langt højere udbytter af stang-formede kardiomyocytter i forhold til tidligere offentliggjorte protokoller. Desuden udviklede vi en billedanalyseplatform til at kategorisere kardiomyocytter automatisk baseret på kernedannelse og ploidy. Med disse nye metoder, grupper kan plette kardiomyocytter for forskellige proteiner, og studere cardiomyocyte ploidy og nucleation status som surrogater for den regenerative potentiale i hjertet.
Den protokol, der er beskrevet her, er forholdsvis ligetil og kan udføres uden avanceret udstyr. Mængden af kollagen og inkubationstid for fordøjelsen kan variere afhængigt af kollagensen parti, og virksomheden giver det. Vi brugte kollagenase type 2, da dette er mest udbredt til at fordøje hjertet for at opnå levende kardiomyocytter. Baseret på vores observationer, besluttede vi, at natten inkubation med 60 mg/ml kollagenase type 2 er optimal for næsten alle musehjerter uanset niveauet af fibrose. Vi har aldrig haft et problem med overdigestion som intracellulære proteiner er faste og ikke så tilgængelige som ekstracellulær kollagen. Men hvis hjertet ikke er fordøjet ordentligt, mere energisk trituration kan være nødvendig, hvilket forårsager celle fragmentering på grund af forskydning stress. Således er det afgørende at sikre, at hjertet er fordøjet ordentligt, før du går videre til trituration. Stivhed i hjertet kan testes ved at klemme med pincet til at vurdere graden af fordøjelsen. Efter inkubation med kollagenase, bør hjerter være mindre stiv og let at rive fra hinanden. Andre typer af kollagenase kan også anvendes. En tidligere rapport brugte en kombination af collagenases B og D14.
Desuden mener vi, at denne protokol kan bruges til at vurdere det samlede antal kardiomyocytter i hjertet15. Men hvis målet er at opnå og kvantificere alle kardiomyocytter fra hjertet, er det vigtigt at inkubere hjerter i længere tid i kollagenvæskeopløsningen (f.eks. 3-7 dage), hvor kollagenaseopløsningen skal genopfyldes en gang om dagen. Dette vil minimere uoverensstemmelser i isolation effektivitet ved at fjerne virkningen af graden af trituration på cardiomyocyte udbytte.
Brugen af DNA-indhold til at måle ploidy er ikke ny, og har været anvendt i flow cytometri i årtier. For nylig blev det vist, at mikroskopi ligeledes kan bruges til at estimere DNA-indhold pr. kerne16. Her har vi gennemført denne strategi for at måle ploidy af cardiomyocyte kerner, som et surrogat for nydannede kardiomyocytter. Dogmet inden for hjerteregenerering er, at kun mononukleerede, diploid kardiomyocytter kan gennemgå cytokinese og give anledning til nye kardiomyocytter. Da det er meget udfordrende at måle nye kardiomyocyte dannelse in vivo, isolere kardiomyocytter, der er blevet jaget efter administration af en DNA nukleotid analog og bestemme niveauet af monokernede, diploid cardiomyocytes er blevet brugt som en tilnærmelse af hjertets evne til at generere nye kardiomyocytes17. Her giver vi en makro til ImageJ, der giver nem kvantificering af cardiomyocyte ploidy. Der skal i det mindste måles 500 kerner for at opnå et nøjagtigt skøn over placeringen af G1-toppen. Hvis der sørges for, at farvning og billeddannelse betingelser er konsistente på tværs af alle brønde af den afbildede plade, kun 500 kerner på tværs af hele prøven skal afbildes, ellers skal der være 500 kerner pr billede gruppe18,19. Begrænsninger af billeddannelse-baseret måling af kerner og ploidy omfatter vanskeligheder med at skelne kerner fra klæbende celler fra faktiske cardiomyocyte kerner, når du bruger to-dimensionelle billeder. Sådanne klæbende celler kan resultere i overvurdering af mængden af flerkernede celler og mindske nøjagtigheden af målinger af tetraploide kardiomyocytkernepopulationen. En mulig strategi for at løse dette problem ville være at bruge kardiomyocyt nukleare markør PCM16,20. Men vi har haft problemer med at opnå pålidelige PCM1 farvning på korrekt faste celler eller væv.
En anden potentiel begrænsning er, at nogle nukleare plet billeder kan have betydelig baggrund cytoplasmic farvning, forhindrer korrekt tærskelring ved hjælp af Fijis indbyggede metoder uden omfattende forbehandling. Desuden reducerer den uregelmæssige bidrag af denne baggrund fluorescens i ploidy skøn deres nøjagtighed. Hvis cellerne ikke efterlades i DNA-farvningsopløsning i tilstrækkelig tid, vil fluorescerende farvestof desuden ikke binde sig til mætning i kernerne, og antagelsen om et lineært forhold mellem nuklear integreret intensitet og DNA-indhold vil ikke længere være nøjagtig.
Det skal bemærkes, at softwaren ikke kan segmentere cardiomyocyte klynger og i stedet fjerner dem fra analyse. Derfor er det af afgørende betydning at frø kardiomyocytter med en relativt lav tæthed (f.eks. 1000 celler/cm2). Yderligere, softwaren kan ikke skelne mellem to kardiomyocytter linet op end-to-end og lange, ental kardiomyocytter. Disse typer af klynger kan fejlagtigt puste multinucleation skøn.
Selv om den beskrevne metode ikke giver mulighed for at opnå levedygtige kardiomyocytter og derfor ikke kan bruges til at måle dynamiske cellulære processer, hvis målet er at udføre immunstaining, mener vi, at den beskrevne metode er bedre end eksisterende protokoller med højere udbytter af kardiomyocytter og bedre kvalitet med hensyn til morfologi og protein lokalisering. Endelig kan den beskrevne metode anvendes til at isolere kardiomyocytter fra kliniske prøver14,21. Vi mener, at den beskrevne metode kan hjælpe forskellige forskere til at opnå høj kvalitet cardiomyocytes og måle nukleation og ploidy som surrogater for nye cardiomyocyte dannelse.
The authors have nothing to disclose.
JHvB er støttet af tilskud fra NIH, Regenerative Medicine Minnesota, og en individuel Biomedical Research Award fra The Hartwell Foundation.
96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
Cytation3 | BioTek | – | Used for automated imaging for DNA analysis |
DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | – | Used for analyzing images |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
Nikon A1R HD25 | Nikon | – | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
R | r-project.org | – | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |