בידוד של קרדיומיוציטים מלבבות קבועים עבור אימונוציטוכימיה וניתוח פלוידי

Summary

מטרת עבודה זו היא לפתח שיטה לבודד באופן רקרדיומיוקיטים מהלב הבוגר ים למדוד תוכן DNA וגרעין.

Abstract

הלב היונק הבוגר מורכב מסוגי תאים שונים, כולל קרדיומיוציטים, תאי אנדותל ופיברובלסטים. מאז קשה לזהות באופן אמין גרעין של cardiomyocytes על חלקים היסטולוגיים, קבוצות רבות מסתמכות על בידוד cardiomyocytes קיימא לפני קיבעון לבצע immunostaining. עם זאת, אלה טכניקות בידוד cardiomyocyte חי דורשים אופטימיזציה כדי למקסם את התשואה, הכדאיות והאיכות של הדגימות, עם תנודות הטבועות מדגימה כדי לדגום למרות אופטימיזציה מקסימלית. כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול לשחזור, המערב קיבעון לפני עיכול אנזימטי של הלב, אשר מוביל לתשואה מקסימלית תוך שמירה על מורפולוגיה vivo של cardiomyocytes בודדים. פיתחנו גם פלטפורמת ניתוח אוטומטית כדי לקבוע את מספר גרעין ותכני DNA לכל גרעין עבור cardiomyocytes בודדים. לאחר שחשף את חלל החזה, הלב נעצר בדיאסטול על ידי עירוי עם 60 mM KCl ב PBS. לאחר מכן, הלב תוקן בתמיסת paraformaldehyde (PFA), ולאחר מכן עיכל עם 60 תמיסת קולגנאז מ”ג/מ”ל. לאחר העיכול, התאים היו ייחודיים על ידי trituration, שבר cardiomyocyte הועשר באמצעות צנטריפוגה דיפרנציאלית. cardiomyocytes מבודדים היו מוכתמות עבור Troponin T α-actinin כדי להעריך את טוהר האוכלוסייה שהושגה. יתר על כן, פיתחנו פלטפורמת ניתוח תמונה כדי לקבוע גרעין cardiomyocyte ומצב ploidy בעקבות כתמי DAPI. הערכות פלואידיות מבוססות תמונה הובילו לתוצאות עקביות ותו לא. לכן, עם פרוטוקול זה, ניתן לשמר מורפולוגיה מקורית של cardiomyocytes בודדים כדי לאפשר אימונוציטוכימיה וניתוח תוכן DNA תוך השגת תשואה מקסימלית.

Introduction

מחלת לב הייתה הגורם המוביל למוות ברוב מדינות המערב במשך עשורים רבים^1,2. למרות שיפורים רבים בטיפול במחלות לב וכלי דם השתפרו ההישרדות, אין כרגע טיפולים שיכולים להחליף קרדיומיוציטים אבודים. לכן, מחקרים הקשורים לתפקוד cardiomyocyte, התפשטות, אפופטוזיס והיפרטרופיה היו וממשיכים להיות מוקד מרכזי של הקהילה המדעית. מאז הלב היונקים הבוגר יש יכולת התחדשות מוגבלת מאוד, עם שיעור חידוש cardiomyocyte מוערך של פחות מ 1% בשנה, חשוב מאוד לזהות באופן אמין אירועי התפשטות cardiomyocyte^3,4. רוב האסטרטגיות המודדות אירועים משגשגים מסתמכות על כתמות עבור אנלוגים נוקלאוטידים של דנ”א משולבים כדי להעריך התפשטות קודמת או נוכחית, או כתם עבור סמנים גרעיניים של^{התפשטות פעילה 5}. חשוב במיוחד לזהות באופן אמין אירועים התפשטות cardiomyocyte מאז המספר הכולל של cardiomyocytes התפשטות הוא^{כל כך נמוך 3,6}. לדוגמה, בהתבסס על שיעור חידוש של 1% של cardiomyocytes אנדוגני בשנה, אפשר לצפות למצוא בין 25 ו 50 cardiomyocytes להיות משגשג בכל זמן נתון בלב העכבר הבוגר^7,8. כל אי דיוקים בזיהוי גרעיני קרדיומיוציט עלולים להוביל לתוצאות חיוביות שגויות. לכן, זה קריטי לזהות באופן אמין גרעיני cardiomyocyte, אשר הוכיח קשה ולא אמין מסעיפים היסטולוגיים⁹. זיהוי של cardiomyocytes הוא הרבה יותר מדויק מתאי יחיד מאשר מקטעי רקמות כפי שזה עשוי להיות קשה להבחין cardiomyocytes מסוגי תאים אחרים גם בעת שימוש סמנים כגון α-actinin, למרות PCM1 עשוי להיות סמן אמין של גרעיני cardiomyocyte בסעיפים היסטולוגיים¹⁰.

הפרוטוקולים הנוכחיים מסתמכים על בידוד cardiomyocytes חיים לפני קיבעון, אשר ידוע לגרום למוות של לפחות 30% cardiomyocytes, עלול להוביל לבחירה בשוגג של אוכלוסיות ספציפיות של cardiomyocytes¹¹. יתר על כן, פרוטוקולים אלה ידועים לשמצה קשה לייעל כדי לספק תוצאות לשחזור. אפילו טכניקות בידוד ממוטבות יכולות בדרך כלל לייצר לא יותר מ-65% חיים, קרדיומיוציטים בצורת מוט עם תשואות^{שונות 12}.

כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו פרוטוקול המאפשר לחוקרים לבודד קרדיומיוקיטים קבועים. מכיוון שהדגימות קבועות לפני הבידוד, התפוקה מוגדלת, ומורפולוגיה vivo נשמרת היטב. יתר על כן, עם פרוטוקול זה ניתן לבודד cardiomyocytes מדגימות קליניות, אשר בדרך כלל קבועים מיד לאחר הרכש. יתר על כן, כדי לזהות cardiomyocytes שנוצר לאחרונה, חשוב למדוד את הגרעין ואת מצב תחבולה של cardiomyocytes בודדים, מאז רק קרדיומיוציטים דיפלואיד הם הניחו בדרך כלל נוצר לאחרונה. ציתום זרימה אינו יכול להבחין רב-תזונה מפוליפלואידית והוא פרוטוקול זמן ומשאבים עתירי יחסית. חלוקה ידנית ומדידה של גרעין בתוך תמונות היא בעלת תפוקה נמוכה מאוד ונוטה להטיה אנושית. כימות אוטומטי של תמונות של קרדיומיוציטים מוכתמים DAPI קבוע, מבודד פותר את שתי הבעיות האלה. ניתן להשיג קביעת גרעין מבוססת הדמיה והפצות תחבולה עם מינימום זמן ריגנטים המשתמשים בציוד בסיסי.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת מינסוטה (IACUC). 1. הכנת פתרונות וציוד כירורגי לפני הבידוד, לחטא את הציוד הכירורגי באמצעות 70% תמיסת אתנול. הוסף 2.24 גרם של KCl ל 500 מ”ל פוספט פוספט תמיסת מלח (PBS) כדי להשיג ריכוז סופי של 60 mM. אחסן פתרון KCl-PBS בטמפרטורת החדר. השתמש בפתרון 3 מ”ל של KCl-PBS לכל עכבר. לדלל 32% תמיסת paraformaldehyde (PFA) עם PBS לתוך כדי לקבל ריכוז סופי של 4% PFA. הכן 10 מ”ל של 4% PFA ב PBS לכל עכבר. פתרון PFA מדולל ניתן לאחסן ב 4 ° C במשך 2-3 שבועות במיכל זכוכית.הערה: ניתן לאחסן פתרון PFA מוכן של 4% ב- -20°C לפרקי זמן ארוכים יותר. להכין 1 מ”ל של פתרון קולגנאז לכל עכבר על ידי הוספת 60 מ”ג של קולגנאז, סוג 2 לכל 1 מ”ל של PBS. 2. שזור וקיבובעון הלב להנות את החיה באמצעות 2-5% isoflurane עם קצב זרימת חמצן של 1 L/min. אשר את ההרדמה על ידי אישור חוסר תנועה וקצב נשימה נמוך יותר.הערה: הזרקת הפרין (100-500 U/kg) לפני המתת חסד יכולה להגדיל את איכות התא ואת התשואה על ידי מניעת קרישי דם, ובכך לאפשר תזימה יעילה יותר של הלב עם קיבעון. המתת סד החיה על פי מתודולוגיות מאושרות.הערה: פעלנו על פי ההנחיות של האגודה הרפואית הווטרינרית האמריקאית להמתת חסד של בעלי חיים, והשגנו אישור מקומי של IACUC להמתת חסד. מניחים את החיה המתת חסד בתמונת עליונות, והדביקו את הגפיים המורחבות. חותכים דרך החזה כדי לחשוף את הלב באמצעות מספריים קהות. חותכים את באבי האביים היורדים וווין קוויאל נחות. להזרים את הלב על ידי הזרקת 3 מ”ל של תמיסת KCl-PBS דרך החדר השמאלי עם קצב זרימה של 3 מ”ל/ דקה באמצעות משאבה פריסלטית המחוברת למערכת אינפוזיה עם מחט פרפר 23 G (26 G עבור neonates). הקפד לא לנקב דרך המחיצה.הערה: לחלופין, השתמש במחט המחוברת למזרק כדי להזריק פתרונות. להזרים את הלב על ידי הזרקת 10 מ”ל של 4% פתרון PFA במשך 10 דקות באמצעות משאבה פריסלטית בקצב של 1 מ”ל/ דקה. הסר את כל הלב באמצעות מספריים. לאחר הסרת הלב, ניתן לבודד אזור מסוים של הלב על ידי תחכך. הנח את הלב, או קטע ממנו בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל המכיל 1 מ”ל של 4% תמיסת PFA. דגירה הלב על נדנדה בטמפרטורת החדר עם מהירות נדנדה בין 20-30 סל”ד עבור 1 שעה. 3. בידוד של קרדיומיוקיטים קבועים מניחים את הלב בצלחת פטרי המכילה תמיסת PBS. לסחוט את הלב כדי להיפטר מכל PFA שנותר בחדרים, ולשטוף PBS. לשים את הלב הקבוע לתוך חדש 1.5 מ”ל microcentrifuge צינור המכיל פתרון קולגנאז (60 מ”ג / מ”ל). מניחים את הצינור על נדנדה (20-30 סל”ד) ב 37 מעלות צלזיוס עבור דגירה לילה.הערה: להאריך את זמן הדגירה עד שבוע אחד ולחדש את פתרון הקולגנז כל יומיים כדי להפחית את השונות האפשרית בתשואה אם לבבות צפויים להיות פיברוטיים, אשר עשוי לדרוש זמן רב יותר של עיכול קולגן לעכל קולגן extracellular. מכניסים את תמיסת הקולגנס ואת הלב לצלחת פטרי 35 מ”מ. ניתיק את הלב לחתיכות של 1 מ”מ באמצעות מפסים או מספריים. השתמש בפיפטת העברה כדי לתלת עוד יותר את הרקמה התועה למשך 2 דקות. אם חלקיקי רקמות עדיין נשארים בצלחת, השתמש בפיפטת העברה עם פתח צר יותר והמשך טריטורציה. המשך עד שרוב הרקמה מתפרקת.הערה: על טריטורציה גורמת cardiomyocytes בודדים לשבור. הקפד לא להתמזמז על ידי בדיקה קבועה תחת מיקרוסקופ. מניחים רשת ניילון 200-600 μm על פתיחת צינור צנטריפוגה 15 מ”ל.הערה: עבור cardiomyocytes hypertrophied, מומלץ להשתמש 400 μm ניילון רשת במקום 200 μm. להוסיף 5 מ”ל של PBS לצלחת פטרי המכיל תאים תותקים ולסנן את הפתרון באמצעות רשת ניילון, כולל חלקיקי רקמות. לשטוף את רשת ניילון על ידי העברת PBS 4 מ”ל נוספים. צנטריפוגה הפתרון מסונן ב 10-100 x g עבור 1 דקות.הערה: 100 x g צנטריפוגציה לא תניב 100% אוכלוסיית cardiomyocyte טהורה, וכמה תאים שאינם cardiomyocyte צפויים להיכלל. השליכו את הסופרנטנט אלא אם כן אדם רוצה להכתים/להעריך תאי לב שאינם קרדיומיוציטים. תולה מחדש את הכדור ב-10 מ”ל PBS לפני הכתמים. 4. הכתמת קרדיומיוציטים לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגציה ב 100 x g במשך 1 דקות ולהוסיף 5 מ”ל של פתרון permeabilization (למשל, 0.5% Triton X-100 ב PBS). דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה.הערה: עבור שלבים 4.1, 4.2 ו 4.4 להשתמש 15 mL צנטריפוגות צינורות כפי שהוא קל יותר להסיר את supernatant מבלי להפריע כדורי התא לעומת 1.5 מ”ל microcentrifuge צינורות. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ב 100 x g עבור 1 דקות, להוסיף 5 מ”ל של מאגר חסימה (למשל, 3% אלבומין סרום בשרים [BSA] ב PBS) ולרגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגציה ב 100 x g עבור 1 דקות ולהוסיף 1 מ”ל של פתרון נוגדנים ראשי (ב PBS) עם יחס דילול המתאים. העבר את הפתרון לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ”ל ותדגירה קרדיומיוציטים בתמיסת נוגדנים ראשית בתנאים ממוטבים (למשל, 4°C לילה). העבר קרדיומיוציטים עם פתרון נוגדן ראשי לצינור צנטריפוגה של 15 מ”ל והוסף 9 מ”ל של PBS. דגירה cardiomyocytes במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגציה ב 100 x g עבור 1 דקות ולהוסיף 10 מ”ל של PBS. דגירה cardiomyocytes במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה. חזור על שלב זה פעם נוספת. אסוף את התאים על ידי צנטריפוגציה ב 100 x g במשך 1 דקות ולהוסיף את פתרון הנוגדן משני המכיל DAPI. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר על נדנדה, ואחריו חוזר על שלב 4.5 פעמיים כדי לשטוף cardiomyocytes. מניחים את התאים על כיסויים או על לוחות תואמי מיקרוסקופ והמשיכו בהדמיה.הערה: תמונות הכלולות בכתב היד צולמו עם מטרות של 10x ו- 40x. לייזרים בשימוש היו: 405 נארם עבור DAPI, 561 נה”מ עבור אלפא actinin ו 640 נה”מ עבור אדו. 5. תוכנת הדמיה התקנה הערה: בצע יחד עם שלבים אלה באמצעות קובץ משלים 1-SoftwareScreenshots.pdf. הורד את התפלגות פיג’י של ImageJ. פתח את פיג’י. לחץ על עזרה > עדכון… > ניהול אתרי עדכון. בדוק את אתרי העדכון “IJPB-plugins” ו- “Biomedgroup” כדי להוריד את יחסי התלות תוספים אליפסה פיצול ו Morpholibj. לחץ על סגור. פיג’י צריכה להתחיל להוריד את יחסי התלות. הפעל מחדש את פיג’י בסיום. הורד את רסטודיו ופתח אותו. העתק install.packages(c(“ggplot2”, “autothresholdr”, “dplyr”, “purrr”, “jsonlite”, “מבריק”)) לתוך שורת הפקודה של מסוף R והקש על מקש Enter. הקלד “y” בתגובה לכל ההנחיות להתקנת כל יחסי התלות R (צילום מסך 1 בקובץ משלים 1). 6. כימות תמונה פתח פיג’י וגרור “AnalyzeNucleation.py” (מסופק כקובץ קוד משלים) לתוך שורת המצב של פיג’י. אפשרות זו תפתח חלון עריכת קבצי Script. לחץ על הפעל בפינה הימנית התחתונה כדי להתחיל אותה (צילום מסך 2 בקובץ משלים 1). תיבת דו-שיח תצוץ (קובץ משלים 1: צילום מסך 3), ותבקש את המיקום של ספריית נתוני הפלט. כל נתוני הניתוח, הנתונים ונתונים אחרים המשמשים תוכנה זו יאוחסנו בתיקיה זו. תיבת דו-שיח נוספת, גדולה יותר, תצוץ, ותציג את כל הגדרות ניתוחהתמונה (קובץ משלים 1: צילום מסך 4). בחר את המיקום של הספריה המכילה תמונות לניתוח. הזן את תבנית שם הקובץ של התמונה באמצעות ביטויים רגילים. הזן את תבנית שם הקובץ של התמונה, המציינת אילו חלקים של שם הקובץ תואמים לשורה, עמודה, ערוץ ואתר (אופציונלי) בתוך סוגריים מסולסלים, באמצעות ביטויים רגילים. אין לשים רווחים בתוך הגשר. הקף חלקים משתנים של תבנית שם הקובץ ב סוגריים מסולסלים {}. אופן הה נשמרות של קבצים תלוי בתוכנת ההדמיה, וצעד זה יאחזר מידע רלוונטי משם קובץ התמונה.הערה: לדוגמה, מחרוזת העיצובצלחת 1-(? (ב-2015, לאחר ש- 100 מיליון דולר, 1000 דולר ב-2018, ה עמודה>[0-9]+)-(?(?(עמודה) ב-2015, לאחר שהחברה התפטרה מתפקידה כמנכ”לית החברה, התפטרה מתפקידה כמנכ”לית החברה.מתאר שם קובץ המתחיל ב-“Plate 1-“, ואחריו אותית אלפביתית אחת או יותר המציינת את השורה, ואחריה ספרה אחת או יותר המציינת את העמודה, ואחריה “-“, ולאחריה אותית אחת או יותר המציינת את הערוץ, ואחריו “.tif”. האותיות בתוך הסוגריים הזוויתיים כמו “” הן שמות משתנים ומועתקות באופן אוטומטי לנתונים בעת איסוףם. אחד מהשמות המשתנים חייב להיות “” ציין את שם הערוצים שבהם ניתן לראות את הכתם הגרעיני היכן ניתן לראות את הקרדיומיוציטים. שמות אלה חייבים להיות בדיוק כפי שהם בחלק התוהם על-ידי המשתנה “” בשמות קבצי הביטוי הרגילים. ציין כיצד יש לקבץ את התמונות באמצעות שמות משתנים המופרדים באמצעות פסיקים. כל התמונות בתוך קבוצה נתונה ייפתחו וניתחו באצווה אחת. לדוגמה, אם התמונות מחולקות לקבוצות עבור כל באר, ויש באר עבור כל שילוב ייחודי של שורה ועמודה, כתוב “שורה, עמודה” בשדה זה.הערה: משתני קיבוץ אלה חייבים להיות קבוצת משנה של המשתנים המשמשים במחרוזת העיצוב. אל תשתמש ב-“channel” כמשתנה קיבוץ, פעולה זו תפריד בין תמונות ערוץ מתאימות זו לזו. ציין אם התמונות תפורות זו לזו בתמונה באר אחת או נפרדות עבור כל אתר. במקרה הקודם, אין לציין את האתר במחרוזת תבנית שם הקובץ. בחר באיזו שיטת סף להשתמש כדי להפריד את הגרעין מהרקע. כל שיטות הסף הסטנדרטיות של פיג’י זמינות. בדוק שיטות סף שונות כדי לקבוע איזו פעולה מיטבית עבור סט התמונה. בדוגמה זו, בחר בשיטת Otsu. ציין אם יש לחשב מחדש את הסף עבור כל תמונת אתר או אם יש להשתמש באותו סף עבור כל תמונה בקבוצה. ציין אם תמונות הקרדיומיוציט הן שדה בהיר או השתמש בסמן פלורסנט. ציין את שיטת סף קרדיומיוציט. אם Brightfield נבחר בשלב הקודם, שיטת סף זו תחול על תמונות שדה בהיר מסוננים בקצה. ציין אם יש לחשב מחדש את הסף עבור כל תמונת אתר או אם יש להשתמש באותו סף עבור כל תמונה בקבוצה. ציין את מספר השורות של תמונות אתר המכסות כל באר. ציין את מספר העמודות של תמונות אתר המכסות כל באר. ציין את האזור המינימלי של גרעין בפיקסלים. השתמש בגודל מינימלי נמוך בנדיבות, סף גבוה ומדויק יותר יחושב בשלב הניתוח. ציין את האזור המינימלי של קרדיומיוציטים. לאחר בחירת ההגדרות הרצויות, לחצו על ‘אשר’. תמונות הדומה לאלה שנמצאו באורי 3 ואיור 4 יופיעו על המסך, המציגות את השלבים השונים של צינור הניתוח. בדוק תמונות אלה כדי לוודא שהסף והמפולח מתרחשים כראוי. כעת יש למלא את תיקיית התוצאות שנבחרה בנתוני ניתוח(קובץ משלים 1: צילום מסך 5). קבצים מלבד נתוני ניתוח ניתן לשמור בבטחה בתיקיה זו כל עוד שמותיהם אינם מתחילים ב- “cm_”, “nuclei_” או “nucleilink_”. 7. ניתוח נתונים הערה: ניתן לנתח את קבצי csv המיוצרים באופן ידני. כל קבוצת משנה של תמונה מנותחת מפיקה שלישייה של קבצי csv בשם “nuclei(מטה-נתונים).csv”, “nucleilink(מטה-נתונים).csv”, ו-“cardiomyocytes(מטה-נתונים),csv”, שם (מטה-נתונים) מוחלף ברצף של זוגות ערך שם של הטופס “_(שם)=(ערך)”, כאשר (שם) ו-(ערך) הם רצפים של תווים אלפאנומריים הנגזרים ממחרוזות התואמות לביטוי הרגיל שניתן קודם לכן. (לדוגמה, אם שורה ועמודה צוינו בשם הקבצים, יהיו מחרוזות כמו “_row=F” ו- “_column=8”). העמודה השמאלית ללא שם של כל קובץ גרעין וגרעין היא מספר מזהה גרעין. הטור “מין” של קובץ הגרעין הוא המזהה של cardiomyocyte שהכיל הגרעין אמר לחלוטין או 0 אחרת. הטור “מקס” של הגרעין הוא המזהה של cardiomyocyte הממוסספר ביותר שהכיל הגרעין אמר בחלקו, או 0 אחרת. העמודה “ממוצע” של קובץ cardiomyocytes הוא מספר מזהה cardiomyocyte. פתח את “AnalyzeMultinucleatedServer.R” ב- Rstudio (מסופק כקובץ קוד משלים). בראש קובץ זה נמצא משתנה בשם “folderName”. לידו יש קובץ. כאן, הקלד את הנתיב לתיקיית נתוני הפלט שנבחרה בשלב האחרון, ללא קו הנטוי הסופי(קובץ משלים 1: צילום מסך 6). בפינה הימנית העליונה של חלון עריכת סקריפט צריך להיות חץ ירוק עם התווית הפעל יישום. לחץ על חץ זה. ייתכן שטעינת הנתונים תימשך זמן מה ולאפליקציה. בתחילה, שלושה גרפים gating יהיו גלויים, אחד כדי לציין את סף האזור הגרעיני המינימלי תקף, אחד כדי לציין את סף עוצמת ממוצע גרעיני תקף מינימלי, ואחד כדי לציין את הקוטר המינימלי המינימלי feret של קרדיומיוציטים. השתמש במחוונים כדי להגדיר סף זה(קובץ משלים 1: צילום מסך 7).הערה: בכל אחד מהתרשפים האלה, שיא גדול ורחב המתאים לגרעין חוקי או קרדיומיוציטים צריכים להיות נוכחים, מוקף בזנבות רחבים המייצגים פסולת או cardiomyocytes מפולחים לא נכון. השתמש בסף כדי לחתוך זנב אחד של כל אחת מהפסגות. גלול מטה. לחץ על הלחצן החל סף נבחר (התחתון של קובץ משלים 1: צילום מסך 7). לחץ על הלחצן התוויית התפלגות עוצמתי. זה יהפוך את העלילה של התפלגות העוצמה הגרעינית של הדגימה כולה ועלילות משנה נפרדות עבור כל משתנה קיבוץ.הערה: לדוגמה, אם משתני קיבוץ הוזנו לביטוי הרגיל בתיבת הדו-שיח פיג’י, התוויות המציינות את התפלגות העוצמה לפי שורה ובעמודה יופיעו כאן(קובץ משלים 1: צילום מסך 8). אם תנאי תאורה וכתמים היו קבועים על פני החלקים השונים של המדגם, חלקות אלה צריך להראות בבירור שתי פסגות עוצמה, עמעם, גבוה יותר עבור גרעין diploid ובהיר, קצר יותר עבור גרעין tetraploid. וריאציה intrasample תגרום דפוס זה לא להיות גלוי על העלילה של מדגם כולו ויש מגוון גדול במיקום של פסגות diploid ו tetraploid לפי שורה, עמודה, או משתנה קיבוץ אחר. במקרה האחרון, גלול מטה סמן את תיבת הסימון תנרמל בנפרד לפי קבוצה כדי לתת דין וחשבון על וריאציה זו(קובץ משלים 1: צילום מסך 9). לחץ על הכפתור חשב Ploidy (קובץ משלים 1: צילום מסך 9). לחץ על הלחצן התוויית הפצה משוערת של פלוידי. גרפים יופיעו בחלונות הריקים מימין. בגרף המדגם כולו המנורמל, תבנית שתי הפסגות צריכה להיות גלויה אם היא לא הייתה לפני כן. בחר סף כדי לבודד את התעודה ואת פסגות tetraploid אחד מהשני וחריגים באמצעות המחוונים(קובץ משלים 1: צילום מסך 9). גלול מטה. לחץ על הכפתור לחשב Ploidy ו Nucleation (קובץ משלים 1: צילום מסך 10). לחץ על הלחצן התוויה ושמור בתיקיית התוצאות. ההתווה שנשמרה בתיקיית התוצאות שנבחרה תופיע גם בחלון אינטראקטיבי זה(קובץ משלים 1: צילום מסך 10).

Representative Results

קרדיומיוציטים היו מבודדים על פי הפרוטוקול המתואר לעיל. באמצעות שיטה זו, אנו בדרך כלל מקבלים cardiomyocytes ייחודי באופן אחיד כי הם טהורים יחסית מבלי לזהם תאים שאינם cardiomyocyte(איור 1א). Cardiomyocytes מזוהים בקלות תחת מיקרוסקופ שדה בהיר בשל גודלם האופייני וbirefringence שלהם. טכניקה זו קלה ליישום ומספקת תוצאות עקביות מבידודים שונים עם תפוקות קרדיומיוציט דומות ואיכות(איור 1ב’). cardiomyocytes מבודד ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך מספר שבועות לפני שימוש נוסף. Cardiomyocytes שהיו מבודדים על פי הפרוטוקול לעיל יכול לשמש עבור יישומים שונים במורד הזרם, כגון מדידת גודל cardiomyocyte, פלואיד cardiomyocyte ו immunocytochemistry. כתוצאה מייצגת, אנו מראים כי cardiomyocytes מבודד על פי פרוטוקול זה יכול להיות מוכתם באמצעות נוגדנים וazides פלואורוכרום-התואם עבור כימיה לחץ כדי לזהות התאמה לשפות אחרות של חלבונים ספציפיים או כדי לזהות שכפול DNA cardiomyocyte, בהתאמה. לדוגמה, הכתמת cardiomyocytes עם נוגדנים α-actin כדי להראות את דפוס הכתמים Z-line אופייני של סרקומרים(איור 2A). בניסוי נפרד, נתנו את התימידין אנלוגי 5-אתניל-2′-deoxyuridine (EdU) לעכברים לפני בידוד cardiomyocytes קבוע. לאחר בידוד cardiomyocyte, הכתמת עבור EdU משולב באמצעות פרוטוקוליםסטנדרטיים 13, והצליחנו לזהות cardiomyocytes שעברו שלב S או קרדיומיוציטים חד נונוקלציה, binucleated ו trinucleated(איור 2B). כדי להרחיב עוד יותר את השירות של שיטת הבידוד, פיתחנו צינור המאפשר כימות של תחבולה קרדיומיוציט המבוססת על כתמי DNA משולבים. כדי להיות מסוגל למדוד מצב תכסיס של תאים או גרעינים, היינו צריכים לפלח גרעין ו cardiomyocytes. איור 3 מציג ייצוג של האסטרטגיה בה השתמשנו לזיהוי גרעין בודד. ראשית, התמונה המקורית DNA מוכתמתבתמונה (איור 3A)היא סף בהתבסס על עוצמה (איור 3B). כאן, השתמשנו DAPI להכתים ל-DNA, אבל כל צבע גרעיני אחר שמראה מתאם ליניארי עם תוכן DNA יעבוד. התוכנית מאפשרת כל אחת משיטות סף האינטנסיביות של פיג’י להיבחר, אבל בדוגמה זו השיטה של Otsu היה בשימוש. מסיכות גרעיניות הנוגעות לקצה התמונה או קטנות יותר מסף אזור הפיקסל המינימלי שצוין אינן נכללות. לאחר מכן, אליפסות מתאימות למסכות הגרעיניות, פילוח גרעינים בודדים. איור 3C מציג אליפסות אלה המקוונות בתמונה המקורית. לאחר מכן, חורים מתמלאים במסכות, והפיקסלים של התמונה מחולקים לאחר מכן לאזורים המבוססים על איזו אליפסה הם פרוקסימליים ביותר (איור 3D). גבולות שטחים אלה משמשים לאחר מכן כדי לצייר קווים דרך אשכולות גרעיניים, סיום תהליך פילוח גרעיני (איור 3E). השלב הבא כרוך בזיהוי של קרדיומיוציטים. עבור תמונות cardiomyocyte המתקבלות על בסיס תאים מוכתמיםפלורסנט (איור 4A),התהליך דומה מאוד לזה עבור גרעין. התמונה מוגדרת בסף בהתבסס על ערך עוצמה המחושב על-ידי שיטת הסף שנבחרה, במקרה זה שיטת המשולש. מסכות קרדיומיוציט מזוהות הנוגעות בגבול התמונה או נמצאות מתחת לגודל מסוים אינן נכללות וחורים מתמלאים במסכות כדי לספק קרדיומיוציטים מחולקים כראוי(איור 4ב’). בגלל cardiomyocytes יש צורה לא סדירה יותר מאשר גרעינים, אין ניסיון לקטלוח אשכולות cardiomyocyte. במקום זאת, אשכולות אלה אינם נכללים בהתבסס על הקוטר המינימלי הגבוה של Feret במהלך שלב הניתוח. פילוח מתמונות שדה בהירות ממשיך מעט שונה. ראשית, תמונת השדה הבהירההמקורית (איור 4C)מעובדת עם מסנן קצה סובל. מסנן זה מחשב את הערך המוחלט של מעבר הצבע של כל פיקסל בתוך התמונה. פיקסלים באזורים עם שינויים מהירים מקבלים ערכים גבוהים ופיקסלים באזורים חלקים של התמונה מקבלים ערכים נמוכים. תמונה מסוננת קצה זו היא לאחר מכן סף על ידי עוצמה, באמצעות שיטת המשולש, וכתוצאה מכך cardiomyocytes רעולי פנים (איור 4D). מסכות לא סדירות אלה מחליקות וקושרות זו לזו באמצעות סגירה מורפולוגית באמצעות עיגול ברדיוס של 2 פיקסלים, הממלא את כל האזורים הלבנים בתמונה שבה העיגול אינו יכול להתאים מבלי לחפוף אזור שחור(איור 4E). לבסוף, חורים במסכות מתמלאים, אזורים הנוגעים בגבול אינם נכללים, וחלקיקים קטנים מוסרים, ומסיימים את תהליך פילוח cardiomyocyte (איור 4F). באמצעות אסטרטגיית פילוח המתוארת, אנו יכולים לקבוע את מצב הגרעין של cardiomyocytes בודדים. בגישה זו, קבענו את מצב הגרעין של קרדיומיוציטים מבודדים מלבבות של עכברי CD-1 גזעיים בנקודות זמן מוקדמות לאחר הלידה. לבבות של עכברים שזה עתה נולדו (היום הראשון של החיים) הראו כי רוב cardiomyocytes בשלב זה הם mononucleated(איור 5:יילודים). תדירות גבוהה זו של קרדיומיוציטים חד-נו-קוטיים נמוכה בהרבה בעכברים צעירים (בני שבועיים), שם קרדיומיוציטים חד-נוגרפיים הם כ-25% מכלל אוכלוסיית הקרדיומיוציטים(איור 5:ילדותי). לבסוף, אנחנו יכולים למדוד את המצב תכסיס של גרעין בודד בתוך cardiomyocytes, ולקבוע אם הם דיפלואיד או tetraploid. תוצאות אלה מראות תדירות גבוהה יותר של גרעין טטרפלואיד בעכברים מתבגרים (איור 6). איור 1: יעילות בידוד קרדיומיוציט לאחר קיבעון. (א)תמונה מייצגת של קרדיומיוציטים מבודדים מוכתמים DAPI כדי להראות גרעין. (DAPI (כחול), ברייטפילד (אפור)) (ב)תשואה של קרדיומיוציטים מבודד מעכברים שונים בגיל 3 חודשים. קנה מידה של פסים = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו. איור 2: אימונוציטוכימיה של קרדיומיוציטים מבודדים. (א)תמונה מייצגת של קרדיומיוציטים מוכתמים α-אקדמין (α-אקדמין (אדום) ו-DAPI (כחול)). (ב)Cardiomyocytes מוכתם עבור EdU משולב (אדום) ו DAPI (כחול). קרדיומיוציטים מייצגים כי הם mononucleated (שמאל), binucleated (באמצע) ו trinucleated (מימין) ו EdU חיובי מוצגים. קנה מידה של פסים = 50 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו. איור 3: אסטרטגיה לפילוח גרעיני. (A)תמונת ערוץ DAPI מקורית. (ב)תמונה מסוומת (בדוגמה זו, נעשה שימוש בשיטה של Otsu). (ג)מסכות שזוהו מהתמונות המסונות על התמונה המוכתמת המקורית של DAPI. (ד)תסה וורונוי המבוססת על מסכות גרעיניות. (ה)גרעין מפולח סופי, עם אשכולות מפוצלים מסומנים. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו. איור 4: אסטרטגיה לפילוח קרדיומיוציט. (א)טרופונין פלורסנט מקורי אני הכתים את תמונת cardiomyocyte. (ב)תמונה בעלת סף משולש, לאחר מילוי חורים ולא כולל חפצים קטנים ואלה שנוגעים בגבול. (ג)תמונה קרדיומיוקייט שדה בהיר מקורי(D)קצה מסונן ומצורה סף cardiomyocyte תמונה(E)קצה מסוננים תמונה לאחר סגירה מורפולוגית עם רדיוס של שני פיקסלים (F) אותה תמונה לאחר מילוי חורים ולא כולל אובייקטים קטנים ואלה נוגעים בגבול. קנה מידה ברים = 100 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של דמות זו. איור 5: סיווג קרדיומיוציטים בהתבסס על מספר הגרעינים. לבבות יילודים (בן יום אחד) מכילים יותר קרדיומיוציטים חד-נוגרפיים מאשר לבבות צעירים (בני 14 ימים). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 6: הפצת תכולת דנ”א קרדיומיוציט לכל גרעין. בנילודים (משמאל), 13.5% מגרעין CM חד-גרעיני הם טטרפלואידים ו-11.9% מגרעין CM בינוקלי הם טטרפלואידים. בקטינים (מימין), 33.9% מגרעין CM חד-גרעיני הם טטרפלואידים ו-31.2% מגרעין CM בינוקלי הם טטרפלואידים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. קובץ משלים 1: צילומי מסך של תוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה). קובץ משלים 2: AnalyzeNucleation.py. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה). קובץ משלים 3: ניתוחמוטרוינטיתסר.ר. אנא לחץ כאן כדי להציג קובץ זה (לחץ לחיצה ימנית להורדה).

Discussion

מאז cardiomyocytes לא ניתן לשמור בתרבות, חשוב לבודד cardiomyocytes ראשוני כדי להיות מסוגל ללמוד את הארכיטקטורה שלהם ולתפקד¹¹. לפיכך, טכניקות בידוד cardiomyocyte היו בשימוש נרחב בתחום הלב. אם המטרה היא לקבוע היבטים פונקציונליים של cardiomyocytes, חשוב לבודד cardiomyocytes קיימא. אלה cardiomyocytes חיים יכול לשמש גם כדי לבצע immunostaining על cardiomyocytes מבודד. עם זאת, אופטימיזציה של הטכניקה של בידוד cardiomyocytes חי הוא מאתגר מבחינה טכנית, ואפילו הטכניקות הטובות ביותר בדרך כלל רק להניב רק 60-65% קרדיומיוציטים בצורת מוט חיים, ואת קרדיומיוציטים הנותרים הם כל balled^{ולמות או מת 11,12}. כאן פיתחנו טכניקה שתאפשר לחוקרים לתקן תחילה את הלב, ולאחר מכן לבודד קרדיומיוציטים ביעילות. פרוטוקול חדש זה מאפשר תשואות גבוהות בהרבה של cardiomyocytes בצורת מוט בהשוואה לפרוטוקולים שפורסמו בעבר. יתר על כן, פיתחנו פלטפורמת ניתוח הדמיה לסווג cardiomyocytes באופן אוטומטי המבוסס על גרעין ותחבולה. עם מתודולוגיות חדשות אלה, קבוצות יכולות להכתים cardiomyocytes עבור חלבונים שונים, ולחקור cardiomyocyte תכסיס ומצב גרעין כתחליף לפוטנציאל ההתחדשות של הלב.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא פשוט יחסית, ותו לא ניתן לבצעו ללא כל ציוד מתקדם. כמות הקולגן וזמן הדגירה לעיכול עשויה להשתנות בהתאם למקצת הקולגנס, והחברה המספקת אותו. השתמשנו קולגן סוג 2, מאז זה משמש ביותר כדי לעכל את הלב להשגת cardiomyocytes חיים. בהתבסס על התצפיות שלנו, קבענו כי דגירה בן לילה עם 60 מ”ג / מ”ל קולגנאז סוג 2 הוא אופטימלי עבור כמעט כל לבבות העכבר ללא קשר לרמת פיברוזיס. מעולם לא הייתה לנו בעיה של עיכול יתר כמו חלבונים תאיים קבועים ולא נגישים כמו קולגן חוץ תאי. עם זאת, אם הלב אינו מתעכל כראוי, ייתכן שיהיה צורך בטריטורציה נמרצת יותר, מה שגורם לפיצול תאים עקב מתח גייה. לפיכך, חיוני לוודא שהלב מתעכל כראוי לפני שהוא עובר לתלת-תירגולציה. נוקשות של הלב יכול להיבדק על ידי לסחוט עם מפס כדי להעריך את מידת העיכול. בעקבות הדגירה עם קולגנאז, לבבות צריכים להיות פחות נוקשים וקל לקרוע לגזרים. סוגים אחרים של קולגנאז יכולים לשמש גם כן. דו”ח קודם השתמש בשילוב של קולאזנסים B ו- D¹⁴.

יתר על כן, אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להעריך את המספר הכולל של cardiomyocytes בלב¹⁵. עם זאת, אם המטרה היא להשיג ולכימת את כל cardiomyocytes מהלב, חשוב לעורר את הלבבות לפרקי זמן ממושכים בתמיסת הקולגן (למשל, 3-7 ימים), שבו יש לחדש את תמיסת הקולגן פעם ביום. זה יהיה למזער חוסר עקביות ביעילות בידוד על ידי ביטול ההשפעה של מידת הטריטורציה על תפוקת cardiomyocyte.

השימוש בתכני DNA כדי למדוד תכסיס אינו חדש, והיה בשימוש ציתום זרימה במשך עשרות שנים. לאחרונה, הראו כי מיקרוסקופ יכול לשמש באופן דומה כדי להעריך את תוכן ה-DNA לכל גרעין¹⁶. כאן, יישמנו אסטרטגיה זו כדי למדוד תחבולה של גרעיני cardiomyocyte, כפונדקאית עבור cardiomyocytes שנוצר לאחרונה. דוגמה בתחום התחדשות הלב היא כי רק מונורוצלול, קרדיומיוציטים דיפלואיד יכול לעבור ציטוקיניס ולועלות cardiomyocytes חדש. מאז זה מאוד מאתגר למדוד היווצרות cardiomyocyte חדש ב vivo, בידוד cardiomyocytes כי כבר נרדף לאחר ניהול של אנלוגי נוקלאוטיד DNA ולקבוע את רמת mononucleated, קרדיומיוציטים דיפלואיד שימש כעצוב של היכולת של הלב ליצור cardiomyocytes^{חדש 17}. כאן, אנו מספקים מאקרו עבור ImageJ המאפשר כימות קלה של פלואיד cardiomyocyte. לכל הפחות, יש למדוד 500 גרעין כדי להשיג הערכה מדויקת של מיקום פסגת ה-G1. אם ננקט טיפול כדי להבטיח כי תנאי הכתמים וההדמיה עקביים על פני כל באר של הלוח התמונה, רק 500 גרעינים על פני המדגם כולו צריך להיות תמונה, אחרת, צריך להיות 500 גרעינים לכל^{קבוצת תמונה 18,19}. מגבלות של מדידה מבוססת הדמיה של גרעין ותחבולה כוללות קושי להבחין בין גרעין לתאים דבקים מגרעין קרדיומיוציט בפועל, בעת שימוש בתמונות דו-ממדיות. תאים דבקים כאלה עלולים לגרום להערך יתר של כמות התאים המורבים ולהקטין את הדיוק של מדידות של אוכלוסיית גרעין קרדיומיוציט טטרפלואיד. אסטרטגיה אפשרית אחת כדי לפתור בעיה זו תהיה להשתמש סמן גרעיני cardiomyocyte PCM1^6,,20. עם זאת, היו לנו קשיים להשיג כתמי PCM1 אמין על תאים קבועים כראוי או רקמות.

מגבלה אפשרית נוספת היא כי כמה תמונות כתם גרעיני עשוי להיות כתמים צטופלסמיים רקע משמעותי, מניעת סף נכון באמצעות שיטות מובנות של פיג’י ללא עירוש טרום נרחב. בנוסף, התרומה הלא סדירה של פלואורסץ רקע זה להערכות תחבולות מפחיתה את הדיוק שלהם. יתר על כן, אם התאים לא יישארו בתמיסת כתם DNA מספיק זמן, צבע פלורסנט לא יהיה להיקשר רוויה בתוך הגרעין ואת ההנחה של קשר ליניארי בין עוצמה משולבת גרעינית ותוכן DNA כבר לא יהיה מדויק.

יש לציין כי התוכנה אינה יכולה מגזר אשכולות cardiomyocyte ובמקום זה מסיר אותם מניתוח. לכן, חשוב מאוד לזרוע קרדיומיוציטים בצפיפות נמוכה יחסית (למשל, 1000 תאים/ס”מ^2). יתר על כן, התוכנה לא יכולה להבחין בין שני cardiomyocytes בשורה מקצה לקצה וארוך, cardiomyocytes יחיד. אשכולות מסוג זה עשויים לנפח בטעות הערכות רב-תזונה.

למרות השיטה המתוארת אינה מאפשרת להשיג cardiomyocytes קיימא ולכן לא ניתן להשתמש כדי למדוד תהליכים תאיים דינמיים, אם המטרה היא לבצע immunostaining, אנו מאמינים כי השיטה המתוארת עדיפה על פרוטוקולים קיימים עם תשואות גבוהות יותר של cardiomyocytes ואיכות טובה יותר במונחים של מורפולוגיה ומיקום חלבון. לבסוף, השיטה המתוארת יכולה לשמש לבידוד cardiomyocytes מדגימות^{קליניות 14,21}. אנו מאמינים המתודולוגיה המתוארת יכולה לעזור לחוקרים שונים להשיג cardiomyocytes באיכות גבוהה למדוד גרעין ותחבולה כתחליף להיווצרות cardiomyocyte חדש.

Materials

96 wells plate for imaging	Corning	3340	We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging
Alpha actinin	Novus Biologicals	NBP1-32462	This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres
Blunt scissors	Fine Scissor Tools	14072-10	We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
CD-1 mice	Charles river	22	Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population
Collagenase 2	Worthington	LS004177	For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation
Copper (II) sulfate pentahydrate	Sigma-Aldrich	203165-10G	For edu staining
Cy5 Picolyl Azide	Click Chemistry Tools	1177-25	Azide used for edu staining
Cytation3	BioTek	–	Used for automated imaging for DNA analysis
DAPI	Life Technologies	D3571	DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water.
donkey anti-mouse IgG-Alexa568	Life Technologies	A10037	Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes
Forceps	ROBOZ	RS-5137	We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144212	To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5
ImageJ	imagej.net/Fiji/Downloads	–	Used for analyzing images
L-ascorbic acid	Sigma-Aldrich	255564-100G	For edu staining
Needle for infusion	TERUMO	SV*23BLK	We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection
Nikon A1R HD25	Nikon	–	Used to take confocal images of alpha actinin staining
Nylon mesh 200 micron	Elko filtering	03-200/54	Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied)
Nylon mesh 400 micron	Elko filtering	06-400/38	Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes
Phosphate Buffered Saline (1X)	Corning	21-040-CV	This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it
Potassium chloride, Granular	Mallinckrodt	6858	Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature
R	r-project.org	–	Used for data analysis of the measurements obtained from images
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5	Used to buffer EdU staining reaction