Målet med dette arbeidet er å utvikle en metode for å reprodusere kardiomyocytter fra det voksne hjertet og måle DNA-innhold og kjerner.
Det voksne pattedyrhjertet består av ulike celletyper, inkludert kardiomyocytter, endotelceller og fibroblaster. Siden det er vanskelig å pålitelig identifisere kjerner av kardiomyocytter på histologiske seksjoner, er mange grupper avhengige av å isolere levedyktige kardiomyocytter før fiksering for å utføre immunstaining. Imidlertid krever disse live kardiomyocyte isolasjonsteknikkene optimalisering for å maksimere utbyttet, levedyktigheten og kvaliteten på prøvene, med iboende svingninger fra prøve til prøve til tross for maksimal optimalisering. Her rapporterer vi en reproduserbar protokoll, som involverer fiksering før enzymatisk fordøyelse av hjertet, noe som fører til maksimal avkastning samtidig som in vivo morfologien til individuelle kardiomyocytter bevares. Vi videreutviklet en automatisert analyseplattform for å bestemme antall kjerner og DNA-innhold per kjerne for individuelle kardiomyocytter. Etter å ha avslørt brysthulen, ble hjertet arrestert i diastole ved perfusjon med 60 mM KCl i PBS. Deretter ble hjertet løst i 4% paraformaldehyd (PFA) løsning, og deretter fordøyd med 60 mg / ml collagenase løsning. Etter fordøyelsen ble cellene singularisert ved triturasjon, og kardiomyocyttfraksjonen ble beriket via differensial sentrifugering. Isolerte kardiomyocytter ble farget for Troponin T og α-actinin for å vurdere renheten til den oppnådde befolkningen. Videre utviklet vi en bildeanalyseplattform for å bestemme kardiomyocyte kjerner og ploidy status etter DAPI farging. Bildebaserte knepvurderinger førte til konsistente og reproduserbare resultater. Dermed, med denne protokollen, er det mulig å bevare innfødt morfologi av individuelle kardiomyocytter for å tillate immunocytochemistry og DNA innholdsanalyse samtidig som maksimal avkastning.
Hjertesykdom har vært den ledende dødsårsaken i de fleste vestlige land i mange tiår1,2. Selv om mange forbedringer i behandlingen av kardiovaskulære sykdommer har forbedret overlevelse, er det for tiden ingen behandlinger som kan erstatte tapte kardiomyocytter. Derfor har studier relatert til kardiomyocyttfunksjon, spredning, apoptose og hypertrofi vært og fortsetter å være et stort fokus for det vitenskapelige samfunnet. Siden det voksne pattedyrhjertet har en svært begrenset regenerativ kapasitet, med en estimert kardiomyocyttfornyelsesrate på mindre enn 1% per år, er det avgjørende viktig å pålitelig identifisere kardiomyocytter proliferative hendelser3,4. De fleste strategier som måler proliferative hendelser er avhengige av enten flekker for inkorporerte DNA-nukleotidanaloger for å vurdere tidligere eller nåværende spredning, eller flekk for kjernefysiske markører for aktiv spredning5. Det er spesielt viktig å pålitelig identifisere kardiomyocytter proliferative hendelser siden det totale antallet proliferative kardiomyocytter er så lavt3,6. For eksempel, basert på en 1% fornyelsesrate av endogene kardiomyocytter per år, kan man forvente å finne mellom 25 og 50 kardiomyocytter å være proliferative til enhver tid i det voksnemushjertet 7,8. Eventuelle unøyaktigheter i identifisering av kardiomyocyttkjerner kan føre til falske positive resultater. Derfor er det viktig å pålitelig identifisere kardiomyocyttkjerner, noe som har vist seg vanskelig og upålitelig fra histologiske seksjoner9. Identifisering av kardiomyocytter er mye mer nøyaktig fra enkeltceller enn fra vevsseksjoner, da det kan være vanskelig å skille kardiomyocytter fra andre celletyper selv når du bruker markører som α-actinin, selv om PCM1 kan være en pålitelig markør for kardiomyocyttkjerner i histologiskeseksjoner 10.
Nåværende protokoller er avhengige av å isolere levende kardiomyocytter før fiksering, som er kjent for å forårsake død av minst 30% av kardiomyocytter, og kan føre til utilsiktet utvalg av spesifikke populasjoner av kardiomyocytter11. Videre er disse protokollene notorisk vanskelig å optimalisere for å gi reproduserbare resultater. Selv optimaliserte isolasjonsteknikker kan vanligvis ikke produsere mer enn 65% levende, stangformede kardiomyocytter med varierende utbytte12.
For å overvinne disse problemene utviklet vi en protokoll som gjør det mulig for forskere å isolere faste kardiomyocytter. Siden prøvene er faste før isolasjon, er utbyttet maksimert, og in vivo morfologi er godt bevart. Videre, med denne protokollen er det mulig å isolere kardiomyocytter fra kliniske prøver, som vanligvis løses umiddelbart etter innkjøp. Videre, for å identifisere nylig genererte kardiomyocytter, er det viktig å måle kjerne- og ploidystatusen til individuelle kardiomyocytter, siden bare diploid kardiomyocytter vanligvis antas å være nyopprettede. Flow cytometri kan ikke skille multinucleation fra polyploidy og er en relativt tid og ressurskrevende protokoll. Manuell skissering og måling av kjerner i bilder er svært lav gjennomstrømming og utsatt for menneskelig bias. Automatisert kvantifisering av bilder av faste, isolerte DAPI-farget kardiomyocytter løser begge disse problemene. Bildebasert bestemmelse av kjerne- og ploidy-distribusjoner kan oppnås med minst tid og reagenser ved hjelp av grunnleggende utstyr.
Siden kardiomyocytter ikke kan opprettholdes i kultur, er det viktig å isolere primære kardiomyocytter for å kunne studere arkitektur og funksjon11. Derfor har kardiomyocyte isolasjonsteknikker blitt mye brukt i hjertefeltet. Hvis målet er å bestemme funksjonelle aspekter av kardiomyocytter, er det viktig å isolere levedyktige kardiomyocytter. Disse levende kardiomyocytter kan også brukes til å utføre immunstaining på isolerte kardiomyocytter. Men, optimalisere teknikken for å isolere levende kardiomyocytter er teknisk utfordrende, og selv de beste teknikkene vanligvis bare gi 60-65% levende stang-formet kardiomyocytter, og de resterende kardiomyocytter er alle balled opp og døende ellerdød 11,12. Her utviklet vi en teknikk som vil tillate forskere å først fikse hjertet, og deretter isolere kardiomyocytter effektivt. Denne nye protokollen gir mye høyere utbytte av stangformede kardiomyocytter sammenlignet med tidligere publiserte protokoller. Videre utviklet vi en bildeanalyseplattform for å kategorisere kardiomyocytter automatisk basert på kjerner og ploidy. Med disse nye metodene kan grupper flekke kardiomyocytter for forskjellige proteiner, og studere kardiomyocyte ploidy og nucleation status som surrogater for det regenerative potensialet i hjertet.
Protokollen som er beskrevet her er relativt grei, og kan utføres uten avansert utstyr. Mengden collagenase og inkubasjonstid for fordøyelsen kan variere avhengig av collagenase mye, og selskapet som gir den. Vi brukte collagenase type 2, siden dette er mest brukt til å fordøye hjertet for å skaffe levende kardiomyocytter. Basert på våre observasjoner, bestemte vi oss for at inkubasjon over natten med 60 mg / ml kollagenase type 2 er optimal for nesten alle musehjerter uavhengig av nivået av fibrose. Vi har aldri hatt et problem med overbesvær som intracellulære proteiner er løst og ikke så tilgjengelig som ekstracellulært kollagen. Men hvis hjertet ikke fordøyes riktig, kan det være behov for kraftigere triturasjon, noe som forårsaker cellefragmentering på grunn av skjærstress. Dermed er det avgjørende å sørge for at hjertet fordøyes riktig før du går videre til triturasjon. Stivhet i hjertet kan testes ved å klemme med tang for å vurdere graden av fordøyelsen. Etter inkubasjon med kollagenase, bør hjerter være mindre stive og enkle å rive fra hverandre. Andre typer kollagenase kan også brukes. En tidligere rapport brukte en kombinasjon av kollagenaser B og D14.
Videre tror vi at denne protokollen kan brukes til å vurdere totalt antall kardiomyocytter i hjertet15. Men hvis målet er å oppnå og kvantifisere alle kardiomyocytter fra hjertet, er det viktig å inkubere hjertene i lengre perioder i kollagenaseløsningen (f.eks. 3-7 dager), hvor kollagenaseløsningen skal etterfylles en gang om dagen. Dette vil minimere uoverensstemmelser i isolasjonseffektivitet ved å eliminere virkningen av graden av triturasjon på kardiomyocyttutbytte.
Bruken av DNA-innhold for å måle ploidy er ikke nytt, og har blitt brukt i strømningscytometri i flere tiår. Nylig ble det vist at mikroskopi på samme måte kan brukes til å estimere DNA-innhold per kjerne16. Her implementerte vi denne strategien for å måle ploidy av kardiomyocyttkjerner, som et surrogat for nydannede kardiomyocytter. Dogmet innen hjerteregenerering er at bare mononukleerte, diploid kardiomyocytter kan gjennomgå cytokinese og gi opphav til nye kardiomyocytter. Siden det er svært utfordrende å måle ny kardiomyocyttdannelse in vivo, har isolerende kardiomyocytter som har blitt jaget etter administrering av en DNA-nukleotidanalog og bestemme nivået av mononukleated, diploid kardiomyocytter blitt brukt som en tilnærming av hjertets evne til å generere nye kardiomyocytter17. Her gir vi en makro for ImageJ som gjør det enkelt å kvantifisere kardiomyocyte ploidy. I det minste må 500 kjerner måles for å oppnå et nøyaktig estimat av plasseringen av G1-toppen. Hvis det tas hensyn til at farging og bildeforhold er konsistente på tvers av hver brønn av den avbildede platen, må bare 500 kjerner over hele prøven avbildes, ellers må det være 500 kjerner per bildegruppe18,,19. Begrensninger av bildebasert måling av kjerner og ploidy inkluderer vanskeligheter med å skille kjerner fra tilhengerceller fra faktiske kardiomyocyttkjerner, ved bruk av todimensjonale bilder. Slike tilslutningsceller kan føre til overvurdering av mengden av multinukleated celler og redusere nøyaktigheten av målinger av tetraploid kardiomyocytt kjernepopulasjonen. En mulig strategi for å løse dette problemet ville være å bruke cardiomyocyte kjernefysisk markør PCM16,20. Vi har imidlertid hatt problemer med å oppnå pålitelig PCM1 farging på riktig faste celler eller vev.
En annen potensiell begrensning er at noen kjernefysiske flekkbilder kan ha betydelig bakgrunn cytoplasmatisk farging, og forhindrer riktig tersklering ved hjelp av Fijis innebygde metoder uten omfattende forbehandling. I tillegg reduserer det uregelmessige bidraget fra denne bakgrunnsfluorescen til ploidy estimater nøyaktigheten. Videre, hvis cellene ikke er igjen i DNA-farging løsning for tilstrekkelig tid, fluorescerende fargestoff vil ikke binde seg til metning i kjernene og antagelsen om en lineær sammenheng mellom kjernefysisk integrert intensitet og DNA-innhold vil ikke lenger være nøyaktig.
Det bør bemerkes at programvaren ikke kan segmentere kardiomyocytter klynger og i stedet fjerner dem fra analyse. Derfor er det kritisk viktig å frø kardiomyocytter med relativt lav tetthet (f.eks. 1000 celler/cm2). Videre kan programvaren ikke skille mellom to kardiomyocytter stilt opp ende-til-ende og lange, entall kardiomyocytter. Slike klynger kan feilaktig blåse opp multinucleation estimater.
Selv om den beskrevne metoden ikke tillater å oppnå levedyktige kardiomyocytter og dermed ikke kan brukes til å måle dynamiske cellulære prosesser, hvis målet er å utføre immunstaining, tror vi at den beskrevne metoden er bedre enn eksisterende protokoller med høyere utbytte av kardiomyocytter og bedre kvalitet når det gjelder morfologi og protein lokalisering. Til slutt kan den beskrevne metoden brukes til å isolere kardiomyocytter fra kliniske prøver14,21. Vi tror den beskrevne metodikken kan hjelpe ulike forskere med å oppnå kardiomyocytter av høy kvalitet og måle kjerner og ploidy som surrogater for ny kardiomyocyttdannelse.
The authors have nothing to disclose.
JHvB støttes av tilskudd fra NIH, Regenerative Medicine Minnesota og en individuell Biomedical Research Award fra The Hartwell Foundation.
96 wells plate for imaging | Corning | 3340 | We use these plates as they are suitable for imaging, although glass bottom plates would be better for confocal imaging |
Alpha actinin | Novus Biologicals | NBP1-32462 | This antibody is used as a marker of cardiomyocyte sarcomeres |
Blunt scissors | Fine Scissor Tools | 14072-10 | We prefer blunt scissors as the possibility of tearing heart tissue is lower when exposing the heart |
C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 664 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
CD-1 mice | Charles river | 22 | Used for imaging, assessing ploidy and nucleation in cardiomyocyte population |
Collagenase 2 | Worthington | LS004177 | For the purpose of this protocol, the batch to batch differences are minimal and don't affect overall yield and quality of the isolation |
Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma-Aldrich | 203165-10G | For edu staining |
Cy5 Picolyl Azide | Click Chemistry Tools | 1177-25 | Azide used for edu staining |
Cytation3 | BioTek | – | Used for automated imaging for DNA analysis |
DAPI | Life Technologies | D3571 | DAPI used for DNA staining. Stocks were dissolved in distilled water. |
donkey anti-mouse IgG-Alexa568 | Life Technologies | A10037 | Secondary antibody used to detect alpha actinin staining within cardiomyocytes |
Forceps | ROBOZ | RS-5137 | We use these curved, blunt forceps, although straight forceps could also be used |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144212 | To set pH of Tris-HCl buffer to pH 8.5 |
ImageJ | imagej.net/Fiji/Downloads | – | Used for analyzing images |
L-ascorbic acid | Sigma-Aldrich | 255564-100G | For edu staining |
Needle for infusion | TERUMO | SV*23BLK | We use winged infusion sets throughout the protocol as it is easy to manipulate the position of the needle with these sets during injection |
Nikon A1R HD25 | Nikon | – | Used to take confocal images of alpha actinin staining |
Nylon mesh 200 micron | Elko filtering | 03-200/54 | Mesh used for filtering regular cardiomyocytes (not hypertrophied) |
Nylon mesh 400 micron | Elko filtering | 06-400/38 | Mesh used for filtering hypertrophied adult cardiomyocytes |
Phosphate Buffered Saline (1X) | Corning | 21-040-CV | This can also be prepared in the lab. Although sterility is important in this experiment, we think it is sufficient to prepare PBS and filtering it |
Potassium chloride, Granular | Mallinckrodt | 6858 | Granular potassium chloride was preffered by us as it forms less aggregates when stored in room temperature |
R | r-project.org | – | Used for data analysis of the measurements obtained from images |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | Used to buffer EdU staining reaction |