Purificação de Fibroblastos e Células Schwann de nervos sensoriais e motores in Vitro
Summary
Aqui, apresentamos um método para purificar fibroblastos e células Schwann de nervos sensoriais e motores in vitro.
Abstract
As principais células do sistema nervoso periférico são as células Schwann (SCs) e os fibroblastos. Ambas as células expressam claramente os fenótipos sensoriais e motores envolvidos em diferentes padrões de expressão genética de fator neurotrófico e outros processos biológicos, afetando a regeneração nervosa. O presente estudo estabeleceu um protocolo para obter SCs sensoriais e motores de ratos altamente purificados e mais rapidamente. A raiz ventral (nervo motor) e a raiz dorsal (nervo sensorial) de ratos neonatais (7 dias de idade) foram dissociadas e as células foram cultivadas por 4-5 dias, seguidas pelo isolamento de fibroblastos sensoriais e motores e SCs, combinando métodos diferenciais de digestão e adesão diferencial sequencialmente. Os resultados das análises de imunocytoquímica e citometria de fluxo mostraram que a pureza das SCs sensoriais e motoras e dos fibroblastos foi de >90%. Este protocolo pode ser usado para obter um grande número de fibroblastos/SCs sensoriais e motores mais rapidamente, contribuindo para a exploração da regeneração sensorial e do nervo motor.
Introduction
No sistema nervoso periférico, as fibras nervosas consistem principalmente de axônios, células schwann (SCs) e fibroblastos, e também contém um pequeno número de macrófagos, células endoteliais microvasculares e células imunes1. Os SCs envolvem os axônios em uma proporção de 1:1 e são fechados por uma camada de tecido conjuntivo chamada endoneurium. Os axônios são então empacotados para formar grupos chamados fascicles, e cada fascículo é envolto em uma camada de tecido conjuntivo conhecida como perineúrio. Finalmente, toda a fibra nervosa é envolta em uma camada de tecido conjuntivo, que é denominada como epineurium. No endônio, toda a população celular é composta por 48% de SCs, e uma parte substancial das células remanescentes envolve fibroblastos2. Além disso, os fibroblastos são componentes importantes de todos os compartimentos nervosos, incluindo o epineurium, o perineúrio e o endônio3. Muitos estudos indicaram que as SCs e os fibroblastos desempenham um papel crucial no processo de regeneração após as lesões nervosas periféricas4,,5,6. Após a transeção do nervo periférico, os fibroblastos perineurial regulam a classificação celular através da via de sinalização efrinina-B/EphB2 entre SCs e fibroblastos, orientando ainda mais o recrescimento axonal através das feridas5. Os fibroblastos nervosos periféricos secretam a proteína tenascin-C e aumentam a migração de SCs durante a regeneração nervosa através da via de sinalização β1-integrin7. No entanto, os SCs e os fibroblastos utilizados nos estudos acima foram derivados do nervo ciático, que inclui nervos sensoriais e motores.
No sistema nervoso periférico, os nervos sensoriais (nervos aferentes) conduzem sinalização sensorial dos receptores para o sistema nervoso central (SNC), enquanto os nervos motores (nervos eferentes) conduzem sinais do SNC aos músculos. Estudos anteriores indicaram que as SCs expressam fenótipos motores e sensoriais distintos e secretam fatores neurotróficos para suportar a regeneração nervosa periférica8,,9. De acordo com um estudo recente, os fibroblastos também expressam diferentes fenótipos motores e sensoriais e afetam a migração das SCs10. Assim, a exploração das diferenças entre fibroblastos/SCs motores e nervosos sensoriais nos permite estudar os complicados mecanismos moleculares subjacentes da regeneração específica do nervo periférico.
Atualmente, existem muitas maneiras de purificar SCs e fibroblastos, incluindo a aplicação de agentes antimitóticos, citolise mediada por anticorpos11,,12, imunopanning sequencial13 e substrato de laminina14. No entanto, todos os métodos acima removem fibroblastos e preservam apenas os SCs. SCs e fibroblastos altamente purificados podem ser obtidos pela tecnologia de classificação de citometria de fluxo15,mas é uma técnica demorada e cara. Assim, neste estudo, foi desenvolvido um método simples de digestão diferencial e adesão diferencial para purificar e isolar fibroblastos sensoriais e motores e SCs, a fim de obter um grande número de fibroblastos e SCs mais rapidamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
As duas principais populações celulares de nervos periféricos incluíam SCs e fibroblastos. Os fibroblastos e SCs principalmente cultivados podem auxiliar com precisão na modelagem da fisiologia de fibroblastos e SCs durante o desenvolvimento e regeneração do nervo periférico. O estudo mostrou que as células nervosas ciáticas de ratos P7 continham cerca de 85% das SCs S100-positivas, 13% dos fibroblastos OX7 positivos e apenas 1,5% dos macrófagos OX42 positivos13. Embora o número de fib…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (Grant No. 2017YFA0104703), a Fundação Natural Nacional da China (Grant No. 31500927).
Materials
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Life Technologies | A11005 | Dilution: 1:400 |
| CoraLite488-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG(H+L) | Proteintech | SA00013-1 | Dilution: 1:400 |
| Confocal laser scanning microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Cell Quest software | Becton Dickinson Biosciences | ||
| D-Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170112 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ2-ILST | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10099-141C | |
| Forskolin | Sigma | F6886-10MG | |
| Fluoroshield Mounting Medium | Abcam | ab104135 | |
| Fixation medium/Permeabilization medium | Multi Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTD | GAS005 | |
| Flow cytometry | Becton Dickinson Biosciences | FACS Calibur | |
| Mouse IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) – Isotype Control | Abcam | ab106163 | Dilution: 1:400 |
| Mouse monoclonal anti-CD90 antibody | Abcam | ab225 | Dilution: 1:1000 for ICC, 0.1 µg for 106 cells for Flow Cyt |
| Mouse anti-S100 antibody | Abcam | ab212816 | Dilution: 1:400 |
| Polylysine (PLL) | Sigma | P4832 | |
| Recombinant Human NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 EGF Domain Protein | R&D Systems | 396-HB-050 | |
| 0.25% (w/v) trypsin | Gibco | 25200-072 |
Referências
- Stierli, S., et al. The regulation of the homeostasis and regeneration of peripheral nerve is distinct from the CNS and independent of a stem cell population. Development (The Company of Biologists). , (2018).
- Schubert, T., Friede, R. L. The role of endoneurial fibroblasts in myelin degradation. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 40 (2), 134-154 (1981).
- Dreesmann, L., Mittnacht, U., Lietz, M., Schlosshauer, B. Nerve fibroblast impact on Schwann cell behavior. European Journal of Cell Biology. 88 (5), 285-300 (2009).
- Lavdas, A. A., et al. Schwann cells engineered to express the cell adhesion molecule L1 accelerate myelination and motor recovery after spinal cord injury. Experimental Neurology. 221 (1), 206-216 (2010).
- Parrinello, S., et al. EphB signaling directs peripheral nerve regeneration through Sox2-dependent Schwann cell sorting. Cell. 143 (1), 145-155 (2010).
- Benito, C., Davis, C. M., Gomez-Sanchez, J. A. STAT3 Controls the Long-Term Survival and Phenotype of Repair Schwann Cells during Nerve Regeneration. Journal of Neuroscience Research. 37 (16), 4255-4269 (2017).
- Zhang, Z. J., Jiang, B. C., Gao, Y. J. Chemokines in neuron-glial cell interaction and pathogenesis of neuropathic pain. Cellular and Molecular Life Sciences. 74 (18), 3275-3291 (2017).
- Hoke, A., et al. Schwann cells express motor and sensory phenotypes that regulate axon regeneration. Journal of Neuroscience. 26 (38), 9646-9655 (2006).
- Brushart, T. M., et al. Schwann cell phenotype is regulated by axon modality and central-peripheral location, and persists in vitro. Experiment Neurology. 247, 272-281 (2013).
- He, Q., et al. Differential Gene Expression in Primary Cultured Sensory and Motor Nerve Fibroblasts. Frontiers in Neuroscience. 12, 1016 (2018).
- Weinstein, D. E., Wu, R. Chapter 3, Unit 17: Isolation and purification of primary Schwann cells. Current Protocols in Neuroscience. , (2001).
- Palomo Irigoyen, M., et al. Isolation and Purification of Primary Rodent Schwann Cells. Methods in Molecular Biology. 1791, 81-93 (2018).
- Cheng, L., Khan, M., Mudge, A. W. Calcitonin gene-related peptide promotes Schwann cell proliferation. Journal of Cell Biology. 129 (3), 789-796 (1995).
- Pannunzio, M. E., et al. A new method of selecting Schwann cells from adult mouse sciatic nerve. Journal of Neuroscience Methods. 149 (1), 74-81 (2005).
- Shen, M., Tang, W., Cao, Z., Cao, X., Ding, F. Isolation of rat Schwann cells based on cell sorting. Molecular Medicine Reports. 16 (2), 1747-1752 (2017).
- He, Q., Man, L., Ji, Y., Ding, F. Comparison in the biological characteristics between primary cultured sensory and motor Schwann cells. Neuroscience Letters. 521 (1), 57-61 (2012).
- Weiss, T., et al. Proteomics and transcriptomics of peripheral nerve tissue and cells unravel new aspects of the human Schwann cell repair phenotype. Glia. 64 (12), 2133-2153 (2016).
