用于活、完整组织中细胞分部分析的果蝇拉瓦尔和普帕尔睾试验的制备

Summary

该协议的目的是使用果蝇美细胞精细胞，通过活细胞和固定细胞显微镜分析完整组织中细胞分裂。该协议演示了如何从果蝇幼虫和早期幼虫中分离出完整、完整的睾口，以及如何处理和安装它们进行显微镜检查。

Abstract

实验性分析活细胞、完整组织和器官中的分裂，对于我们理解细胞分裂如何与发育、组织平衡和疾病过程结合至关重要。接受梅氏病的果蝇精子细胞是这种分析的理想选择，因为 （1） 含有精子细胞的整个果蝇睾比相对容易准备显微镜，（2） 精子细胞的体积大使它们非常适合高分辨率成像，（3） 强大的果蝇遗传工具可与体内分析相结合。在这里，我们提出了一个易于访问的协议，用于制备来自果蝇的第三颗幼虫和早期幼虫的整个睾试验。我们描述了如何识别制备的整个睾底中的微细胞，以及如何通过延时显微镜来描绘它们的生活。还提供了固定和免疫染色整个睾试验的协议。与使用成人睾测试进行精子细胞分析的现有协议，幼虫睾试验的使用有几个优点。最重要的是，幼虫睾比比成人睾比更小，对细胞的挤拥程度更低，这极大地方便了精子细胞的高分辨率成像。为了证明这些优点和协议的应用，我们展示了在通过延时共聚焦显微镜成像的单一精子细胞中，在细胞分裂过程中，内质视网膜在主轴微管的再分配。协议可以结合表达任意数量的荧光标记蛋白或细胞标记，以及基因突变和其他遗传工具，使这种方法特别强大，分析细胞分裂机制在整个组织和器官的生理背景下。

Introduction

细胞分裂通常^{使用培养1}中生长的细胞系进行研究。虽然我们从这些研究中获得了丰富的宝贵见解和理解基本机制^2，但培养中生长的细胞不能完全概括细胞分裂的生理，因为它发生在完好的活组织中。例如，在完好的组织和器官中，细胞必须在正确的地点和正确的时间进行分裂，以便后代细胞正确位于组织内，以便它们能够进行适当的分化或功能程序，使细胞增殖与组织生长或平衡³适当协调。另一方面，对于在培养中生长的细胞，细胞分裂一般受培养媒介⁴的生长因子调节，因此我们不能从这些细胞中学习体内环境因素，如组织结构或发育信号如何影响分裂过程。还必须注意，许多用于研究细胞分裂的细胞系，如HeLa和U2OS细胞，都来自转移性肿瘤^5。因此，与健康细胞相比，这些癌细胞的基本生理的许多方面，如细胞周期调节机制和染色体稳定性，都可能发生变化。因此，对细胞分裂生理学的完全理解取决于我们研究其原生体内的分裂细胞的能力，这些环境中保存了生理调节机制和组织结构。

理解细胞分裂如何在完好的组织和器官内运作的进展受到体内或外体分析所固有的困难的阻碍。首先，在大型器官或厚组织中，很难或不可能进入分裂细胞进行微观分析。其次，通常很难预测单个细胞何时在体内分裂。第三，组织生理学在外活体培养过程中可能迅速恶化。在此协议中，我们描述了在完全完好的睾口中接受微粒细胞分裂时，对果蝇黑色无粒细胞进行活和固定分析的易访问方法。这些细胞是活的、活的、活的分析的理想选择，因为它们很容易通过标准光学方法（如共聚焦显微镜）访问，它们在可预测的时间和地点进行分裂，并且完整的睾试验可在体内培养下保持长达 24 小时。此外，果蝇精子细胞是大圆形细胞（直径约20~30μm），在分裂时不会改变形状，因此非常适合对细胞组分（如主轴装置和细胞质细胞器）进行高分辨率、延时成像。虽然这些细胞经历梅氏病，而不是线虫病，许多必要的细胞分裂过程是非常相似的这两个细胞分裂机制^6。这些优势，加上强大的果蝇遗传工具，使果蝇精子细胞成为一个广泛使用的模型，用于对基本细胞分裂过程进行前活体分析，包括主轴形成和调节、细胞激酶和细胞机重塑和分区^{7、8、9、10、11。8,9,10,117}

精子细胞是处于精子成形阶段的细胞。在果蝇，精子生成开始于一组生殖系干细胞，位于一个小区域或”枢纽”在睾比^12，13,13的一个极点。这些细胞被不对称的线粒体分裂，产生一个单一的分化精子。然后，精子经过四个同步线粒体，产生一组16个细胞，在单个囊肿内保持密切关联。在这个阶段，细胞从线粒体过渡到半胱细胞循环，被称为精子细胞。精子细胞在细胞周期的G2延长阶段花费大约两到三天，在此期间，它们急剧生长，并经历细胞学变化，为两个间皮分裂和随后的精子发生^13，14,14做准备。在单个囊肿内，整个16个精子细胞组，然后同时进入第一个囊肿。因此，在细胞分裂中可以同时成像几种美细胞。第一次美粒分进行约1.5小时，几乎立即跟随第二个美粒分，产生64个总精子，继续分化成成熟的精子。

使用精子细胞研究活的、完整组织的细胞分裂的一个独特优点是，细胞的组或囊肿在精子成世的不同阶段不断进步，精子成世各个阶段的细胞通常可以在任何给定的睾瘤中识别（见图3A）。因此，在整个睾试验中相对容易找到碘细胞。我们通常将分析重点放在第一个而不是第二个美病上，因为这些细胞更大，更容易接受高分辨率成像，但包含两个网格分裂的整个过程可以成功成像。还应注意的是，睾精制剂和培养的一般协议也可用于分析精子生成的其他过程，例如早期的线粒体干细胞或精子分裂，或当精子成熟成精子¹⁵时发生的细胞学变化。精子成世的许多方面在果蝇和人类^之间高度保存。

果蝇精子细胞开始达到精子成形的膜阶段，在果蝇发育的第三个星幼虫阶段^13。因此，从生命周期阶段分离的睾试验从第三颗星幼虫开始，包括幼虫和成人可用于分析精子细胞的分裂。一些优秀的协议可用于从成年雄性苍蝇中提取睾子，用于活和固定分析精子生成17，18，19。^17,18,19这些协议对于研究精子成世的晚期或必须使用仅在成人中可见的遗传标记可能更可取。该协议侧重于幼虫和早期普帕的睾制剂，因为这些阶段的睾试验具有几个优点，这些优点与高分辨率延时显微镜的细胞分裂分析特别相关。首先，幼虫和幼虫的睾比成人小，器官内的细胞不那么拥挤。因此，分裂精子细胞通常可以在幼虫睾试验的外表面附近成像，而不必穿透多层光散射组织。其次，成人睾试验由于附加的附属器官收缩而有节奏地移动，这些运动使单个细胞的延时成像具有挑战性。第三，幼虫睾试验在研究导致阴极或成人致命性的基因突变时是有利的。我们的方法针对显微镜阶段睾试验的长期培养进行了优化，允许在同一制备中通过精子成能的多个阶段对多轮细胞分裂或单个细胞的进展进行成像。我们还描述了一种用于固定和免疫染色整个睾试验的协议。总体而言，我们的协议对于有兴趣研究完整组织中细胞分裂的人特别有用，能够将精子细胞分析与高可处理的果蝇遗传工具相结合，使得这种方法特别有力。

Protocol

1. 准备动物、工具和介质进行解剖 交叉雄性苍蝇和雌性苍蝇，以获得所需的基因型的后代。用于鉴定和分期的转基因标记包括GFP-tubulin标记的美质主轴和RFP-组音2A来标记染色体8。每十字架使用5至10只雌性，并在25°C的培养箱中保持标准飞食上的十字架，直到第三只小幼虫开始爬起小瓶的两侧（4~5天）。早白的小狗将在一天后开始形成。 获得两对带细尖的直钳。确?…

Representative Results

成功执行此协议后，通过共聚焦显微镜或其他荧光显微镜方法进行成像的睾口将完全完好无损。如图3A所示，睾牛的细胞组织得以保存，细胞分化从睾酮的一端到另一端（包括精子、精子细胞和单倍体精子）的进展是可见的。GFP-tubulin是识别精细胞分裂和细胞通过梅氏肿的活体成像的有用标记。如图3B所示，关于开始梅氏病的精子细胞可以通过他们的两?…

Discussion

我们已经描述了一种用于制备幼虫或早期果蝇睾试验的协议，该测试针对精子细胞细胞分裂的长期活成像进行了优化。这是分析完整组织生理语境中细胞分裂的有力方法。当与果蝇遗传工具结合使用时，这种方法的力量会进一步扩大，例如特定的基因突变、组织特异性RNAi介导的抑制以及荧光标记的蛋白质和细胞标记物。此外，幼虫和脓器睾试验体积小，以及成像离玻璃罩滑非常近的…

Materials

5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22×22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium