Preparazione dei test di Drosophila Larval e Pupal per l'analisi della divisione cellulare in live, tessuto intatto

Summary

L’obiettivo di questo protocollo è quello di analizzare la divisione cellulare nel tessuto intatto mediante microscopia cellulare viva e fissa utilizzando spermatociti meioticiti della Drosophila. Il protocollo dimostra come isolare i testicoli interi e intatti dalle larve di Drosophila e dalle prime pupe, e come elaborarli e montarli per la microscopia.

Abstract

L’analisi sperimentale delle cellule che si dividono in tessuti e organi vivi e intatti è essenziale per la nostra comprensione di come la divisione cellulare si integra con lo sviluppo, l’omeostasi dei tessuti e i processi della malattia. Gli spermatociti di Drosophila sottoposti a meiosi sono ideali per questa analisi perché (1) testiti di Drosophila interi contenenti spermatociti sono relativamente facili da preparare per la microscopia, (2) le grandi dimensioni degli spermatociti li rendono adatti per l’imaging ad alta risoluzione e (3) potenti strumenti genetici della Drosophila possono essere integrati con l’analisi in vivo. Qui, presentiamo un protocollo facilmente accessibile per la preparazione di interi testicoli da Drosophila terza larve instar e pupe prime. Descriviamo come identificare gli spermatociti meiotici in teste interi preparati e come immaginerli dal vivo per microscopia time-lapse. Vengono inoltre forniti protocolli per la fissazione e l’immunostaining dei teste interi. L’uso di testicoli larvali ha diversi vantaggi rispetto ai protocolli disponibili che utilizzano testicoli adulti per l’analisi dello spermatocite. Ancora più importante, i testicoli larvali sono più piccoli e meno affollati di cellule rispetto ai testicoli adulti, e questo facilita notevolmente l’imaging ad alta risoluzione degli spermatociti. Per dimostrare questi vantaggi e le applicazioni dei protocolli, presentiamo risultati che mostrano la ridistribuzione del reticolo endoplasmico rispetto ai microtubuli del mandrino durante la divisione cellulare in un unico spermatocito immagine di microscopia confocale time-lapse. I protocolli possono essere combinati con l’espressione di qualsiasi numero di proteine fluorescenti o marcatori di orgelli, così come mutazioni genetiche e altri strumenti genetici, rendendo questo approccio particolarmente potente per l’analisi dei meccanismi di divisione cellulare nel contesto fisiologico di interi tessuti e organi.

Introduction

La divisione cellulare è spesso studiata utilizzando linee cellulari coltivate nella coltura¹. Mentre abbiamo acquisito una ricchezza di informazioni e comprensione inestimabili dei meccanismi fondamentali da questi studi², le cellule coltivate in coltura non possono ricapitolare completamente la fisiologia della divisione cellulare come si verifica in tessuto intatto e vivente. Ad esempio, nei tessuti e negli organi intatti, le cellule devono dividersi nel posto giusto e al momento giusto in modo che le cellule progenie siano correttamente posizionate all’interno del tessuto, in modo che possano sottoporsi a opportune differenziazioni o programmi funzionali, e in modo che la proliferazione cellulare sia adeguatamente coordinata con la crescita del tessuto o l’omeostasi^{3 .} Per le cellule cresciute nella coltura d’altra parte, la divisione cellulare è generalmente regolata da fattori di crescita nel mezzo di coltura⁴, e quindi non possiamo imparare da queste cellule come fattori ambientali in vivo come l’architettura dei tessuti o la segnalazione dello sviluppo influenzano il processo di divisione. È anche importante notare che molte delle linee cellulari utilizzate per studiare la divisione cellulare, come le cellule HeLa e U2OS, sono state derivate da tumori metastatici⁵. Pertanto, molti aspetti della fisiologia di base di queste cellule tumorali, come i meccanismi regolatori del ciclo cellulare e la stabilità cromosomica, sono stati probabilmente alterati rispetto alle cellule sane. La comprensione completa della fisiologia della divisione cellulare, quindi, dipende dalla nostra capacità di studiare le cellule divisorie nei loro ambienti nativi in vivo che preservano i meccanismi regolatori fisiologici e l’architettura dei tessuti.

I progressi nella comprensione del funzionamento della divisione cellulare all’interno di tessuti e organi intatti sono ostacolati da difficoltà inerenti all’analisi in vivo o ex vivo. In primo luogo, può essere difficile o impossibile accedere alle cellule divisorie per l’analisi microscopica all’interno di grandi organi o tessuti spessi. In secondo luogo, è spesso difficile prevedere quando le singole cellule si dividono in vivo. In terzo luogo, la fisiologia dei tessuti può deteriorarsi rapidamente durante la coltura ex vivo. In questo protocollo, descriviamo metodi facilmente accessibili per l’analisi live e fissa degli spermatociti della Drosophila melanogaster mentre vengono sottoposti a divisioni cellulari meiotiche all’interno di testicoli completamente intatti. Queste cellule sono ideali per l’analisi live, ex vivo perché sono facilmente accessibili con metodi ottici standard come la microscopia confocale, si dividono in tempi e luoghi prevedibili e i teste intatti possono essere mantenuti nella coltura ex vivo fino a circa 24 h. Inoltre, gli spermatociti della Drosophila sono grandi cellule rotonde (circa 20-30 m di diametro) che non cambiano forma quando si dividono, il che le rende ideali per l’imaging ad alta risoluzione e time-lapse di componenti cellulari come l’apparato del mandrino e gli organelli citoplasmici. Anche se queste cellule subiscono la meiosi al contrario della mitosi, molti dei processi di divisione cellulare essenziali sono molto simili tra questi meccanismi di divisione delle due cellule⁶. Questi vantaggi, combinati con potenti strumenti genetici della Drosophila, hanno reso gli spermatociti della Drosophila un modello ampiamente utilizzato per l’analisi ex vivo di processi di divisione cellulare essenziali, tra cui la formazione e la regolazione del mandrino, la citochina e il rimodellamento delle orgenelle e la partizionamento^{di 7,8,9,10,11}.

Gli spermatociti sono cellule che sono allo stadio meiotico della spermatogenesi. In Drosophila,la spermatogenesi inizia con un gruppo di cellule staminali germinali che si trovano in una piccola regione o “hub” in un polo del testicolo^12,13. Queste cellule si dividono per una mitosi asimmetrica, dando origine a un singolo spermatogonio differenziato. La Spermatogonia viene quindi sottoposta a quattro mitosi sincroni per produrre un gruppo di 16 celle che rimangono strettamente associate all’interno di una singola cisti. In questa fase, le cellule passano da un mitotico a un ciclo cellulare meiotico e sono indicate come spermatociti. Gli spermatociti trascorrono circa due o tre giorni in una fase G2 estesa del ciclo cellulare, durante i quali crescono drammaticamente e subiscono cambiamenti citologici in preparazione per le due divisioni meiotiche e la successiva spermiogenesi^13,14. L’intero gruppo di 16 spermatociti all’interno di una singola cisti entra quindi nella prima divisione meiotica allo stesso tempo. Così, diversi spermatociti meiotici possono essere immagine contemporaneamente mentre procedono attraverso la divisione cellulare. La prima divisione meiotica procede per circa 1,5 h ed è seguita quasi immediatamente dalla seconda divisione meiotica, producendo 64 spermatidi totali che si differenziano in spermatozoi maturi.

Un vantaggio unico dell’utilizzo di spermatociti per studiare la divisione cellulare nel tessuto vivo e intatto è che gruppi o cisti di cellule progrediscono costantemente attraverso le diverse fasi della spermatogenesi, e le cellule in tutte le fasi della spermatogenesi di solito possono essere identificate in qualsiasi testicolo dato (vedi Figura 3A). Pertanto, è relativamente facile trovare cellule meiotiche in testicoli interi. Generalmente concentriamo le nostre analisi sulla prima anziché sulla seconda meiosi perché queste cellule sono molto più grandi e più suscettibili all’imaging ad alta risoluzione, ma l’intero processo che comprende entrambe le divisioni meiotiche può essere immaginato con successo. Va anche notato che il protocollo generale per la preparazione e la coltura dei testicoli può essere utilizzato per analizzare anche altri processi di spermatogenesi, come le precedenti cellule staminali mitotiche o divisioni spermatogoniche o i cambiamenti citologici che si verificano quando gli spermatidi maturano in spermatozoi¹⁵. Molti di questi aspetti della spermatogenesi sono altamente conservati tra la Drosophila e gli esseri umani¹⁶.

Gli spermatociti della Drosophila iniziano a raggiungere la fase meiotica della spermatogenesi durante la terza fase larvale instar dello sviluppo della Drosophila ¹³. Pertanto, i testicoli isolati dalle fasi del ciclo di vita a partire da larve instelle e tra cui pupe e adulti possono essere utilizzati per l’analisi di spermatociti divisori. Diversi protocolli eccellenti sono disponibili per l’estrazione di testicoli da mosche maschili adulte per l’analisi live e fissa della spermatogenesi^17,18,19. Questi protocolli possono essere preferibili per studiare le fasi tardive della spermatogenesi o se devono essere utilizzati marcatori genetici che sono visibili solo negli adulti. Il protocollo si concentra invece sulla preparazione dei testicoli da larve e pupe prime, perché i testicoli in queste fasi hanno diversi vantaggi che sono specificamente pertinenti all’analisi della divisione cellulare mediante microscopia ad alta risoluzione e time-lapse. In primo luogo, i testicoli di larve e pupe sono più piccoli di quelli degli adulti e le cellule all’interno dell’organo sono meno affollate. Per questo motivo, la divisione degli spermatociti può spesso essere vista vicino alla superficie esterna dei testicoli larve, senza dover penetrare attraverso più strati di tessuto di dispersione della luce. In secondo luogo, i testicoli adulti si muovono ritmicamente a causa delle contrazioni degli organi accessori collegati, e questi movimenti rendono difficile l’imaging time-lapse di singole cellule. E terzo, i testicoli larvali sono vantaggiosi quando si studiano le mutazioni genetiche che causano la letalità pupa o adulto. I nostri metodi sono ottimizzati per la coltura a lungo termine di testicoli sullo stadio del microscopio, consentendo l’imaging di più cicli di divisione cellulare o la progressione di singole cellule attraverso più fasi di spermatogenesi nella stessa preparazione. Descriviamo anche un protocollo per la fissazione e l’immunostaining di interi teste. Nel complesso, i nostri protocolli sono particolarmente utili per coloro che sono interessati a studiare la divisione cellulare nel tessuto intatto, e la capacità di combinare l’analisi dello spermatocito con strumenti genetici della Drosophila altamente trattabili lo rende un approccio particolarmente potente.

Protocol

1. Preparare animali, strumenti e supporti per la dissezione Attraversare mosche maschili e femminili per ottenere la progenie del genotipo desiderato. Indicatori transgenici utili per l’identificazione e la messa in scena di spermatociti meiotici includono GFP-tubulina per etichettare il mandrino meiotico e RFP-histone 2A per etichettare i cromosomi8. Utilizzare da cinque a dieci femmine per croce e mantenere le croci sul cibo a mosca standard nelle fiale in un’incubatrice di 25 gradi c…

Representative Results

Quando questo protocollo viene eseguito con successo, i testicoli rimarranno completamente intatti per l’imaging mediante microscopia confocale o altri metodi di microscopia a fluorescenza. Come si è visto nella Figura 3A, l’organizzazione cellulare dei testicoli è preservata e la progressione della differenziazione cellulare da un’estremità del testicolo all’altra, tra cui spermatogonia, spermatociti e spermatidi aploidi è visibile. GFP-tubulina è un marcatore utile per identificare la…

Discussion

Abbiamo descritto un protocollo per la preparazione di testicoli della Drosophila larvale o pupilla precoce, ottimizzato per l’imaging live a lungo termine della divisione delle cellule di spermatocite. Questo è un metodo potente per l’analisi della divisione cellulare nel contesto fisiologico del tessuto intatto. Il potere di questo metodo è ulteriormente ampliato se combinato con strumenti genetici della Drosophila, come specifiche mutazioni genetiche, soppressione mediata dall’RNAi specifici dei te…

Materials

5" Dissecting Probe	Fisher	08-965-A
5.75" Glass Pasteur Pipet	Fisher	13-678-20A
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher	BP9703-100
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Straight forcepts with fine tips
Frosted Microscope Slides	Fisher	12-544-2	Slides for mounting fixed tissue, with frosted writing surface
Halocarbon oil 700	Sigma	H8898-100 mL
Lumox Dish 50	Sarstedt	SAR946077410	Gas-permeable tissue culture dish
Microscope Cover Glass	Fisher	12-541-B	22×22 mm, #1.5 glass coverslip
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-15	Insect pins used to make scalpel tool
Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Tools	26018-17
Paraformaldehyde 32% Solution, EM Grade	Electron Microsocopy Sciences	15714
Plan Beveled Edge Microscope Slides	Fisher	12-549-5	Slides used for dissections
PYREX Spot Plates	Fisher	13-748B	9-well glass dissecting dish
Schneider's Drosophila medium	Fisher	21720-024
Syringe Filter, 0.22 µm	EMD Millipore	SLGS033SB
Triton X-100	Fisher	BP151-500
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Microscopy mounting medium