Ballistische etikettering van piramidale neuronen in hersenschijfjes en in de primaire celcultuur
Summary
We presenteren een protocol voor het etiketteren en analyseren van piramidale neuronen, wat essentieel is voor het evalueren van potentiële morfologische veranderingen in neuronen en dendritische stekels die ten grondslag kunnen liggen aan neurochemische en gedragsafwijkingen.
Abstract
Er is gemeld dat de grootte en vorm van dendritische stekels is gerelateerd aan hun structurele plasticiteit. Om de morfologische structuur van piramidale neuronen en dendritische stekels te identificeren, kan een ballistische etiketteringstechniek worden gebruikt. In het huidige protocol worden piramidale neuronen gelabeld met DilC18(3) kleurstof en geanalyseerd met behulp van neuronale reconstructie software om neuronale morfologie en dendritische stekels te beoordelen. Om neuronale structuur te onderzoeken, worden dendritische vertakkingsanalyse en Sholl-analyse uitgevoerd, waardoor onderzoekers conclusies kunnen trekken over respectievelijk dendritische vertakkingcomplexiteit en neuronale arbor-complexiteit. De evaluatie van dendritische stekels wordt uitgevoerd met behulp van een automatische ondersteunde classificatie algoritme integraal onderdeel van de reconstructie software, die stekels ingedeeld in vier categorieën (dat wil zeggen, dun, paddestoel, stompe, filopodia). Bovendien worden ook drie extra parameters (d.w.z. lengte, hoofddiameter en volume) gekozen om veranderingen in de dendritische wervelkolommorfologie te beoordelen. Om het potentieel van brede toepassing van de ballistische etiketteringstechniek te valideren, werden piramidale neuronen uit in vitro celkweek met succes gelabeld. Over het algemeen is de ballistische etiketteringsmethode uniek en nuttig voor het visualiseren van neuronen in verschillende hersengebieden bij ratten, die in combinatie met geavanceerde reconstructiesoftware onderzoekers in staat stelt om de mogelijke mechanismen die ten grondslag liggen te verduidelijken neurocognitieve disfunctie.
Introduction
In 2000, Gan et al. beschreven een snelle etikettering techniek voor individuele neuronen en glia in het zenuwstelsel dat verschillende lipofiele kleurstoffen gecombineerd, waardoor voor de gelijktijdige etikettering van vele hersencellen met verschillende kleuren1,2. Meer recent, een ballistische etikettering techniek werd beschreven door Seabold et al.3 dat fluorescerende kleurstoffen (Dil) geïntroduceerd in de neuronen van de hersenen plakjes. Een veelzijdige kleuring techniek, ballistische etikettering wordt gewaardeerd om zijn vermogen om te worden gebruikt in meerdere diersoorten en over een breed scala van leeftijden. Bovendien kan het worden gecombineerd met immunokleuring om subpopulaties van hersencellen te identificeren3. In vergelijking met traditionele technieken (bijvoorbeeld Golgi-Cox zilverimpregnatie, micro-injectie)4biedt ballistische etikettering een mogelijkheid om morfologische kenmerken duidelijker te onderscheiden, waaronder dendritische stekels, een functie die van cruciaal belang is voor het tekenen van conclusies over neuronale complexiteit en synaptische connectiviteit5.
Excitatory piramidale neuronen worden gekenmerkt door een enkele, grote apicale dendriet, meerdere kortere basale dendrieten, en duizenden dendritische stekels6. Piramidale neuronen worden gevonden in meerdere hersengebieden in verband met hogere orde cognitieve verwerking, met inbegrip van de prefrontale cortex (PFC) en hippocampus. In de PFC worden piramidale neuronen waargenomen in lagen II/III en laag V, waarbij elk unieke morfologie vertoont. In het bijzonder, piramidale neuronen in laag II/III van de PFC hebben een kortere apicale dendriet en minder vertakking dan piramidale neuronen in laag V6. Binnen de hippocampus bevinden zich piramidale neuronen in zowel de CA1- als de CA3-regio’s, waarbij elk verschillende morfologieën wordt weergegeven. In het bijzonder vertonen piramidale neuronen in de CA1-regio een meer onderscheidend apicale dendriet, waarbij vertakkingen verder van het soma plaatsvinden, ten opzichte van de CA3-regio6.
Dendritische stekels op piramidale neuronen in zowel de PFC en hippocampus zijn de primaire plaats van excitatory synapsen7. Morfologische kenmerken van dendritische stekels, die klassiek zijn gekarakteriseerd in drie primaire categorieën (d.w.z. dun, stomp, of paddestoel8),zijn gerelateerd aan de grootte van de excitatory synaps9. Dunne stekels, gekenmerkt door een lange, dunne nek, kleine bolvormige hoofd, en kleinere postsynaptische dichtheden, zijn meer onstabiel en ontwikkelen zwakkere verbindingen. Echter, paddestoel stekels, die een grotere dendritische wervelkolom hoofd hebben, worden erkend voor het vormen van sterkere synaptische verbindingen, een effect als gevolg van hun grotere omvang. In scherp contrast, stompe stekels zijn verstoken van een wervelkolom nek, vertonen een ongeveer gelijke hoofd en nek volume verhouding8. Binnen de hippocampus kunnen ook vertakte stekels worden waargenomen, waarbij de wervelkolom meerdere hoofden heeft die uit dezelfde dendritische wervelkolom nek10komen. Daarom kunnen de morfologische veranderingen van dendritische stekels de functionaliteit en de structurele capaciteit weerspiegelen. Bovendien hebben studies aangetoond dat de grootte en vorm van dendritische stekels betrekking heeft op hun structurele plasticiteit, wat leidt tot het idee dat kleine stekels betrokken zijn bij leren en aandacht, terwijl grotere, stabielere stekels, betrokken zijn bij langetermijnprocessen, waaronder geheugen11. Bovendien kan de verdeling van dendritische stekels langs het dendriet worden geassocieerd met synaptische connectiviteit5,12.
Zo heeft het huidige methodologische document drie doelen: 1) Presenteer ons protocol voor ballistische etikettering, dat is gebruikt met een slagingspercentage (d.w.z. neuronen die voldoen aan selectiecriteria en geschikt zijn voor analyse) van 83,3%5,12,13 en over meerdere hersengebieden (d.w.z. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) De generaliseerbaarheid van de techniek en de toepassing ervan op in vitro gekweekte neuronen aantonen; 3) Detail de methodologie gebruikt in neuronale reconstructie software en de conclusies die kunnen worden getrokken uit dergelijke gegevens.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol beschrijven we een veelzijdige etiketteringstechniek voor neuronen uit zowel rattenhersenen als in vitro gekweekte neuronen. Verder rapporteren we de methodologie voor het gebruik van neuronale reconstructie software en neuronale reconstructie kwantitatieve analyse software om neuronale morfologie en dendritische stekels te beoordelen. De beoordeling van neuronale morfologie en dendritische stekels biedt een kans om veranderingen in dendritische vertakkingscomplexiteit, neuronale arbor complexiteit, dendr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidies HD043680, MH106392, DA013137 en NS100624.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
Referências
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor “DiOlistic” labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
- Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices. Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).
- Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
- McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Science Reports. 9 (1), 827 (2019).
- Spruston, N. Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration. Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).
- Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neurociência. 102, 527-540 (2001).
- Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines. American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).
- Harris, K. M., Sultan, P. Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses. Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).
- Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation. Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).
- Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging. Neurociência. 251, 129-140 (2012).
- McLaurin, K. A., et al. Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat. Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).
- Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).
- Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).
- Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images. PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).
