Ballistische Kennzeichnung von Pyramidal neurons in Gehirnscheiben und in der primären Zellkultur
Summary
Wir präsentieren ein Protokoll zur Kennzeichnung und Analyse pyramidaler Neuronen, das für die Bewertung potenzieller morphologischer Veränderungen in Neuronen und dendritischen Stacheln, die neurochemischen und verhaltensbedingten Anomalien zugrunde liegen können, entscheidend ist.
Abstract
Es wurde berichtet, dass die Größe und Form der dendritischen Stacheln mit ihrer strukturellen Plastizität zusammenhängt. Um die morphologische Struktur von pyramidenförmigen Neuronen und dendritischen Stacheln zu identifizieren, kann eine ballistische Etikettierungstechnik verwendet werden. Im vorliegenden Protokoll werden pyramidale Neuronen mit DilC18(3)-Farbstoff gekennzeichnet und mit neuronaler Rekonstruktionssoftware analysiert, um neuronale Morphologie und dendritische Stacheln zu bewerten. Zur Untersuchung der neuronalen Struktur werden dendritische Verzweigungsanalysen und Sholl-Analysen durchgeführt, die es den Forschern ermöglichen, Rückschlüsse auf die dendritische Verzweigungskomplexität bzw. die neuronale Arbor-Komplexität zu ziehen. Die Auswertung der dendritischen Stacheln erfolgt mit einem automatischen assistierten Klassifizierungsalgorithmus, der zur Rekonstruktionssoftware integriert ist und die Stacheln in vier Kategorien einreibt (d. h. dünn, Pilz, stumpf, filopodia). Darüber hinaus werden weitere drei Parameter (z. B. Länge, Kopfdurchmesser und Volumen) ausgewählt, um Veränderungen in der dendritischen Wirbelsäulenmorphologie zu bewerten. Um das Potenzial einer breiten Anwendung der ballistischen Etikettierungstechnik zu validieren, wurden pyramidale Neuronen aus der In-vitro-Zellkultur erfolgreich gekennzeichnet. Insgesamt ist die ballistische Etikettierungsmethode einzigartig und nützlich für die Visualisierung von Neuronen in verschiedenen Hirnregionen bei Ratten, was es Forschern ermöglicht, die möglichen Mechanismen zu klären, die neurokognitive Dysfunktion.
Introduction
Im Jahr 2000 beschrieben Gan et al. eine schnelle Etikettierungstechnik für einzelne Neuronen und Glia im Nervensystem, die verschiedene lipophile Farbstoffe kombinierte, was die gleichzeitige Kennzeichnung vieler Gehirnzellen mit verschiedenen Farben1,2ermöglichte. In jüngerer Zeit wurde eine ballistische Etikettierungstechnik von Seabold et al.3 beschrieben, die fluoreszierende Farbstoffe (Dil) in die Neuronen von Gehirnscheiben einführte. Eine vielseitige Färbetechnik, ballistische Etikettierung wird für seine Fähigkeit geschätzt, in mehreren Tierarten und über eine breite Palette von Altersgruppen verwendet werden. Darüber hinaus kann es mit Immunostainierung kombiniert werden, um Subpopulationen von Gehirnzellen3zu identifizieren. Im Vergleich zu herkömmlichen Techniken (z. B. Golgi-Cox Silberimprägnierung, Mikroinjektion)4bietet die ballistische Etikettierung die Möglichkeit, morphologische Merkmale, einschließlich dendritischer Stacheln, klarer zu unterscheiden, ein Merkmal, das entscheidend ist, um Rückschlüsse auf neuronale Komplexität und synaptische Konnektivität zu ziehen5.
Exzitatorische pyramidale Neuronen zeichnen sich durch einen einzigen, großen apikalen Dendrit, mehrere kürzere Basaldendriten und Tausende von dendritischen Stacheln6aus. Pyramidale Neuronen sind in mehreren Gehirnregionen im Zusammenhang mit höherer Ordnung kognitive Verarbeitung gefunden, einschließlich der präfrontalen Kortex (PFC) und Hippocampus. In der PFC werden pyramidale Neuronen in den Schichten II/III und Schicht V beobachtet, wobei jede eine einzigartige Morphologie aufweist. Insbesondere pyramidenförmige Neuronen in Schicht II/III der PFC haben einen kürzeren apikalen Dendrit und weniger verzweigt als pyramidale Neuronen in Schicht V6. Innerhalb des Hippocampus befinden sich pyramidale Neuronen sowohl in den CA1- als auch in der CA3-Region, wobei jede unterschiedliche Morphologie zeigt. Insbesondere pyramidenförmige Neuronen in der CA1-Region weisen einen ausgeprägteren apikalen Dendrit auf, wobei verzweigte Verbindungen weiter vom Soma entfernt auftreten, relativ zur CA3-Region6.
Dendritische Stacheln auf pyramidenförmigen Neuronen sowohl im PFC als auch im Hippocampus sind die primäre Stelle für exzitatorische Synapsen7. Morphologische Eigenschaften der dendritischen Stacheln, die klassisch in drei primäre Kategorien (d.h. dünn, stumpf oder Pilz8) charakterisiert sind, wurden mit der Größe der exzitatorischen Synapse9in Verbindung gebracht. Dünne Stacheln, die sich durch einen langen, dünnen Hals, einen kleinen bauchigen Kopf und kleinere postsynaptische Dichten auszeichnen, sind instabiler und entwickeln schwächere Verbindungen. Pilzdornen, die einen größeren dendritischen Wirbelsäulenkopf haben, sind jedoch dafür bekannt, stärkere synaptische Verbindungen zu bilden, ein Effekt, der sich aus ihrer größeren Größe ergibt. Im scharfen Kontrast sind stumpfe Dornen ohne Wirbelsäulenhals, die ein ungefähr gleiches Kopf- und Nackenvolumenverhältnisvon 8aufweisen. Innerhalb des Hippocampus können auch verzweigte Stacheln beobachtet werden, wobei die Wirbelsäule mehrere Köpfe hat, die aus dem gleichen dendritischen Wirbelsäulenhals10hervorgehen. Daher könnten die morphologischen Veränderungen der dendritischen Stacheln Funktionalität und strukturelle Kapazität widerspiegeln. Darüber hinaus haben Studien gezeigt, dass die Größe und Form der dendritischen Stacheln mit ihrer strukturellen Plastizität zusammenhängt, was zu der Idee führt, dass kleine Stacheln am Lernen und an der Aufmerksamkeit beteiligt sind, während größere, stabilere Stacheln an langfristigen Prozessen beteiligt sind, einschließlich Gedächtnis11. Darüber hinaus kann die Verteilung der dendritischen Stacheln entlang des Dendriten mit synaptischen Konnektivität5,12verbunden sein.
So hat das vorliegende methodische Papier drei Ziele: 1) Präsentieren Sie unser Protokoll für die ballistische Kennzeichnung, das mit einer Erfolgsrate (d. h. Neuronen, die Auswahlkriterien erfüllen und für die Analyse geeignet sind) von 83,3%5,12,13 und über mehrere Hirnregionen hinweg (d. h. PFC, Nucleus accumbens, hippocampus) verwendet wurde. 2) Nachweis der Verallgemeinerbarkeit der Technik und ihrer Anwendung auf in vitro angebaute Neuronen; 3) Erläutern Sie die In-Neuronal-Rekonstruktionssoftware verwendete Methodik und die Schlussfolgerungen, die aus solchen Daten gezogen werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine vielseitige Etikettierungstechnik für Neuronen sowohl aus Rattenhirn als auch für in vitro angebaute. Darüber hinaus berichten wir über die Methodik für die Verwendung von neuronaler Rekonstruktionssoftware und neuronaler Rekonstruktionquantitativer Analysesoftware zur Bewertung der neuronalen Morphologie und dendritischer Stacheln. Die Bewertung der neuronalen Morphologie und dendritischen Stacheln bietet die Möglichkeit, Veränderungen in dendritischer Verzweigungskomplexi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch NIH-Stipendien HD043680, MH106392, DA013137 und NS100624 finanziert.
Materials
| 20Gx25mm PrecisionGlide needle | BD | 305175 | |
| 24-well cell culture plate | Costar | 3562 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Barrel liner | BIO-RAD | 165-2417 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Cartridge holder | BIO-RAD | 165-2426 | |
| Confocal imaging software | Nikon | EZ-C1 | version 3.81b |
| Confocal microscope | Nikon | TE-2000E | |
| Cover glass | VWR | 637-137 | |
| DilC18(3) | Fisher Scientific | D282 | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| F344 rat | (Harlan Laboratories, Indianapolis, IN) | ||
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Helios diffusion screens | BIO-RAD | 165-2475 | |
| Helios gene gun kit | BIO-RAD | 165-2411 | |
| Helios gene gun system | BIO-RAD | 165-2431 | |
| Helium hose assembly | BIO-RAD | 165-2412 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Methylene chloride | Fisher Scientific | D150-1 | |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| Neurolucida 360 software | mbf bioscience | dendritic spine analysis | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Fisher Scientific | 5295 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Fisher Scientific | P36930 | mounting medium |
| Rat brain matrix, 300 – 600g, Coronal, 0.5mm | Ted Pella | 15047 | |
| Sevoflurane | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Syringe kit | BIO-RAD | 165-2421 | |
| Tefzel tubing | BIO-RAD | 165-2441 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Tubing cutter | BIO-RAD | 165-2422 | |
| Tubing Prep station | BIO-RAD | 165-2418 | |
| Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 µm | BIO-RAD | 165-2269 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 |
Referências
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- Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).
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