Analyseur de sous-structure : Un flux de travail convivial pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans les images de microscopie de fluorescence

Summary

Nous présentons un flux de travail librement disponible construit pour l’exploration rapide et l’analyse précise des corps cellulaires dans des compartiments cellulaires spécifiques dans des images de microscopie de fluorescence. Ce flux de travail convivial est conçu sur le logiciel open-source Icy et utilise également les fonctionnalités ImageJ. Le pipeline est abordable sans connaissance dans l’analyse d’image.

Abstract

La dernière décennie a été caractérisée par des percées dans les techniques de microscopie de fluorescence illustrées par l’amélioration de la résolution spatiale, mais aussi dans l’imagerie à cellules vivantes et les techniques de microscopie à haut débit. Cela a conduit à une augmentation constante de la quantité et de la complexité des données de microscopie pour une seule expérience. Étant donné que l’analyse manuelle des données de microscopie prend beaucoup de temps, qu’elle est subjective et qu’elle interdit les analyses quantitatives, l’automatisation de l’analyse de la bioimage devient presque inévitable. Nous avons construit un flux de travail informatique appelé Substructure Analyzer pour automatiser entièrement l’analyse du signal dans les bioimages à partir de la microscopie fluorescente. Ce flux de travail est développé sur la plate-forme open-source iux conviviale et est complété par des fonctionnalités d’ImageJ. Il comprend le pré-traitement des images pour améliorer le rapport signal/bruit, la segmentation individuelle des cellules (détection des limites cellulaires) et la détection/quantification des corps cellulaires enrichis dans des compartiments cellulaires spécifiques. Le principal avantage de ce flux de travail est de proposer des fonctionnalités complexes de bio-imagerie aux utilisateurs sans expertise en analyse d’image via une interface conviviale. En outre, il est très modulaire et adapté à plusieurs questions allant de la caractérisation de la translocation nucléaire/cytoplasmique à l’analyse comparative de différents corps cellulaires dans différentes sous-structures cellulaires. La fonctionnalité de ce flux de travail est illustrée par l’étude des corps Cajal (enroulés) dans des conditions de stress oxydatif (OS). Les données de la microscopie de fluorescence montrent que leur intégrité dans les cellules humaines est affectée quelques heures après l’induction de l’OS. Cet effet est caractérisé par une diminution de la nucléation de la coiline dans les corps cajal caractéristiques, associée à une redistribution nucléoplasmique de la coiline dans un nombre accru de foyers plus petits. Le rôle central de la coiline dans l’échange entre les composants CB et le nucléoplasme environnant suggère que la redistribution induite par l’OS de la coiline pourrait affecter la composition et la fonctionnalité des corps de Cajal.

Introduction

La microscopie légère et, plus particulièrement, la microscopie de fluorescence sont des techniques robustes et polyvalentes couramment utilisées en sciences biologiques. Ils donnent accès à la localisation précise de diverses biomolécules comme les protéines ou l’ARN par leur étiquetage fluorescent spécifique. La dernière décennie a été caractérisée par des progrès rapides dans les technologies de microscopie et d’imagerie comme en témoigne le prix Nobel de chimie 2014 qui récompense Eric Betzig, Stefan W. Hell et William E. Moerner pour le développement de la microscopie de fluorescence super-résolue (SRFM)¹. SFRM contourne la limite de diffraction de la microscopie optique traditionnelle pour l’introduire dans la nanodimension. L’amélioration des techniques comme l’imagerie vivante ou les approches de dépistage à haut débit augmente également la quantité et la complexité des données à traiter pour chaque expérience. La plupart du temps, les chercheurs sont confrontés à des populations hétérogènes élevées de cellules et veulent analyser les phénotypes au niveau unicellulaire.

Au départ, des analyses telles que le comptage des foyers ont été effectuées par l’œil, ce qui est préféré par certains chercheurs car il fournit un contrôle visuel complet sur le processus de comptage. Toutefois, l’analyse manuelle de ces données prend trop de temps, entraîne une variabilité entre les observateurs et ne donne pas accès à des fonctionnalités plus complexes de sorte que les approches assistées par ordinateur sont de plus en plus largement utilisées et presque^{inévitables 2}. Les méthodes informatiques de Bioimage augmentent considérablement l’efficacité de l’analyse des données et sont exemptes de la subjectivité inévitable de l’opérateur et du biais potentiel de l’analyse manuelle de comptage. L’augmentation de la demande dans ce domaine et l’amélioration de la puissance informatique ont conduit au développement d’un grand nombre de plates-formes d’analyse d’images. Certains d’entre eux sont disponibles gratuitement et donnent accès à divers outils pour effectuer l’analyse avec des ordinateurs personnels. Une classification des outils d’accès libre a été récemment établie³ et présente Icy⁴ comme un logiciel puissant combinant la facilité d’utilisation et la fonctionnalité. De plus, Icy a l’avantage de communiquer avec ImageJ.

Pour les utilisateurs qui n’ont pas d’expertise en analyse d’image, les principaux obstacles sont de choisir l’outil approprié en fonction des paramètres problématiques et correctement régler qui sont souvent mal compris. De plus, les temps d’installation sont souvent longs. Icy propose une interface point-and-click conviviale nommée « Protocoles » pour développer le flux de travail en combinant certains plugins trouvés dans une collection exhaustive⁴. La conception modulaire flexible et l’interface point-and-click rendent la mise en place d’une analyse réalisable pour les non-programmeurs. Nous présentons ici un flux de travail appelé Substructure Analyzer, développé dans l’interface de Icy, dont la fonction est d’analyser les signaux fluorescents dans des compartiments cellulaires spécifiques et de mesurer différentes caractéristiques comme la luminosité, le nombre de foyers, la taille des foyers et la distribution spatiale. Ce flux de travail aborde plusieurs questions telles que la quantification de la translocation du signal, l’analyse des cellules transfectées exprimant un journaliste fluorescent, ou l’analyse des foyers de différentes sous-structures cellulaires dans les cellules individuelles. Il permet le traitement simultané de plusieurs images, et les résultats de sortie sont exportés vers une feuille de calcul délimitée par onglets qui peut être ouverte dans les programmes de feuille de calcul couramment utilisés.

Le pipeline De substructure Analyzer est présenté à la figure 1. Tout d’abord, toutes les images contenues dans un dossier spécifié sont pré-traitées pour améliorer leur rapport signal/bruit. Cette étape augmente l’efficacité des étapes suivantes et diminue le temps de fonctionnement. Ensuite, les régions d’intérêt (ROV), correspondant aux zones d’image où le signal fluorescent doit être détecté, sont identifiées et segmentées. Enfin, le signal fluorescent est analysé et les résultats sont exportés dans une feuille de calcul délimitée par onglets.

La segmentation des objets (détection des limites) est l’étape la plus difficile dans l’analyse d’image, et son efficacité détermine la précision des mesures cellulaires résultantes. Les premiers objets identifiés dans une image (appelés objets primaires) sont souvent des noyaux d’images tachées d’ADN (taches DAPI ou Hoechst), bien que les objets primaires puissent aussi être des cellules entières, des perles, des taches, des tumeurs ou tout autre objet taché. Dans la plupart des images biologiques, les cellules ou les noyaux se touchent ou se chevauchent, ce qui provoque l’échec des algorithmes simples et rapides. À ce jour, aucun algorithme universel ne peut effectuer une segmentation parfaite de tous les objets, principalement parce que leurs caractéristiques (taille, forme ou texture) modulent l’efficacité de la segmentation⁵. Les outils de segmentation couramment distribués avec des logiciels de microscopie (tels que le logiciel d’imagerie MetaMorph par Molecular Devices⁶, ou le logiciel NIS-Elements Advances Research par Nikon⁷) sont généralement basés sur des techniques standard telles que l’appariement de corrélation, le seuil ou les opérations morphologiques. Bien qu’efficaces dans les systèmes de base, ces méthodes surgénéralisées présentent rapidement des limites lorsqu’elles sont utilisées dans des contextes plus difficiles et spécifiques. En effet, la segmentation est très sensible aux paramètres expérimentaux tels que le type de cellule, la densité cellulaire ou les biomarqueurs, et nécessite souvent des ajustements répétés pour un grand ensemble de données. Le flux de travail Substructure Analyzer intègre des algorithmes simples et plus sophistiqués pour proposer différentes alternatives adaptées à la complexité de l’image et aux besoins des utilisateurs. Il propose notamment l’algorithme de bassin versant⁸ basé sur des marqueurs pour les objets fortement groupés. L’efficacité de cette méthode de segmentation repose sur la sélection de marqueurs individuels sur chaque objet. Ces marqueurs sont choisis manuellement la plupart du temps pour obtenir des paramètres corrects pour la segmentation complète, ce qui prend beaucoup de temps lorsque les utilisateurs font face à un grand nombre d’objets. Substructure Analyzer propose une détection automatique de ces marqueurs, offrant un processus de segmentation très efficace. La segmentation est, la plupart du temps, l’étape limitante de l’analyse d’image et peut modifier considérablement le temps de traitement en fonction de la résolution de l’image, le nombre d’objets par image, et le niveau de regroupement des objets. Les pipelines typiques nécessitent de quelques secondes à 5 minutes par image sur un ordinateur de bureau standard. L’analyse d’images plus complexes peut nécessiter un ordinateur plus puissant et des connaissances de base dans l’analyse d’images.

La flexibilité et la fonctionnalité de ce flux de travail sont illustrées par divers exemples dans les résultats représentatifs. Les avantages de ce flux de travail sont notamment affichés par l’étude des sous-structures nucléaires dans des conditions de stress oxydatif (OS). L’OS correspond à un déséquilibre de l’homéostasie redox en faveur des oxydants et est associé à des niveaux élevés d’espèces réactives d’oxygène (ROS). Puisque ros agissent comme molécules de signalisation, les changements dans leur concentration et la localisation subcellulaire affectent positivement ou négativement une myriade de voies et de réseaux qui régulent les fonctions physiologiques, y compris la transduction du signal, les mécanismes de réparation, l’expression des gènes, la mort cellulaire, et la prolifération^9,10. OS est donc directement impliqué dans diverses pathologies (maladies neurodégénératives et cardiovasculaires, cancers, diabète, etc.), mais aussi dans le vieillissement cellulaire. Par conséquent, déchiffrer les conséquences de l’OS sur l’organisation et la fonction de la cellule humaine constitue une étape cruciale dans la compréhension des rôles de l’OS dans le début et le développement des pathologies humaines. Il a été établi que l’OS régule l’expression des gènes en modulant la transcription à travers plusieurs facteurs de transcription (p53, Nrf2, FOXO3A)¹¹, mais aussi en affectant la régulation de plusieurs processus co- et post-transcriptionnels tels que l’épissage alternatif (AS) des pré-ARN^12,13,14. L’épissage alternatif des transcriptions primaires de codage et de non-codage est un mécanisme essentiel qui augmente la capacité d’encodage des génomes en produisant des isoformes de transcription. AS est effectuée par un énorme complexe de ribonucléoprotéines appelé splicéosome, contenant près de 300 protéines et 5 RN nucléaires riches en U (UsnARN)¹⁵. L’assemblage splicéosome et l’AS sont étroitement contrôlés dans les cellules et certaines étapes de la maturation splicéosome se produisent dans les compartiments nucléaires sans membrane nommés Cajal Bodies. Ces sous-structures nucléaires se caractérisent par la nature dynamique de leur structure et leur composition, qui sont principalement menées par des interactions multivalentes de leur ARN et des composants protéiques avec la protéine coiline. L’analyse de milliers de cellules avec le flux de travail de l’analyseur de sous-structure a permis la caractérisation des effets jamais décrits de l’OS sur les corps de Cajal. En effet, les données obtenues suggèrent que l’OS modifie la nucléation des corps de Cajal, induisant une redistribution nucléoplasmique de la protéine de coiline dans de nombreux foyers nucléaires plus petits. Un tel changement de la structure des corps de Cajal pourrait affecter la maturation du splicéosome et participer à la modulation AS par OS.

Protocol

REMARQUE : Des didacticiels convivial sont disponibles sur le site web de Icy http://icy.bioimageanalysis.org. 1. Télécharger icy et le protocole d’analyseur de sous-structure Téléchargez Icy à partir du site Icy (http://icy.bioimageanalysis.org/download) et téléchargez le protocole Substructure Analyzer : http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest<st…

Representative Results

Toutes les analyses décrites ont été effectuées sur un ordinateur portable standard (processeur quad-core 64 bits à 2,80 GHz avec mémoire d’accès aléatoire (RAM) de 16 Go fonctionnant avec la version 64 bits de Java. La mémoire à accès aléatoire est un paramètre important à considérer, en fonction de la quantité et de la résolution des images à analyser. L’utilisation de la version 32 bits de Java limite la mémoire à environ 1300 Mo, ce qui pourrait être inapproprié pour l’analyse big data, ta…

Discussion

Un nombre croissant d’outils logiciels libres sont disponibles pour l’analyse des images des cellules de fluorescence. Les utilisateurs doivent choisir correctement le logiciel adéquat en fonction de la complexité de leur problématique, de leurs connaissances dans le traitement d’image, et au temps qu’ils veulent passer dans leur analyse. Icy, CellProfiler, ou ImageJ / Fidji sont des outils puissants combinant à la fois la facilité d’utilisation et la fonctionnalité³. Icy est un ou…

Materials

16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free	Thermo Fisher Scientific	28908	to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML	mounting medium
Human: HeLa S3 cells	IGBMC, Strasbourg, France		cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668-019	transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin	abcam	ab11822	Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope	Nikon		epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)	gibco	70011-036	to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	EDC4-specific antibody
Triton X-100	Roth	6683	to permeabilize the cells