Стандартизированная гистоморфометрическая оценка остеоартрита в модели хирургической мыши
Summary
Действующий протокол устанавливает строгий и воспроизводимый метод количественной оценки морфологических изменений суставов, которые сопровождают остеоартрит. Применение этого протокола может быть полезным в мониторинге прогрессирования заболевания и оценке терапевтических вмешательств при остеоартрите.
Abstract
Один из наиболее распространенных заболеваний суставов в Соединенных Штатах, остеоартрит (ОА) характеризуется прогрессирующей дегенерации суставного хряща, в первую очередь в тазобедренных и коленных суставов, что приводит к значительному воздействию на мобильность пациента и качество жизни. На сегодняшний день, Есть нет существующих лечебных методов лечения ОА в состоянии замедлить или ингибировать дегенерацию хряща. В настоящее время существует обширный объем текущих исследований, чтобы понять патологию ОА и открыть новые терапевтические подходы или агенты, которые могут эффективно замедлить, остановить, или даже обратить вспять ОА. Таким образом, крайне важно иметь количественный и воспроизводимый подход для точной оценки Связанных СОвРом патологических изменений в суставном хряще, синовиуме и подхондрятельной кости. В настоящее время, ОА тяжести и прогрессии в первую очередь оцениваются с помощью остеоартрита научно-исследовательского общества International (OARSI) или Манкин скоринга систем. Несмотря на важность этих систем скоринга, они являются полуколичественными и могут зависеть от субъективности пользователя. Что еще более важно, они не в состоянии точно оценить тонкие, но важные, изменения в хряще в начале состояния болезни или ранних фаз лечения. В описанном здесь протоколе используется компьютеризированная и полуавтоматизированная гистоморфетричная система программного обеспечения для создания стандартизированной, строгой и воспроизводимой количественной методологии для оценки совместных изменений в ОА. Этот протокол представляет собой мощное дополнение к существующим системам и позволяет более эффективно обнаруживать патологические изменения в суставе.
Introduction
Один из наиболее распространенных заболеваний суставов в Соединенных Штатах, ОА характеризуется прогрессирующей дегенерации суставного хряща, в первую очередь в тазобедренных и коленных суставов, что приводит к значительному воздействию на мобильность пациента и качество жизни1,2,3. Суставной хрящ является специализированной соединительной ткани диартродиальных суставов, предназначенных для минимизации трения, облегчения движения, и терпеть совместное сжатие4. Суставной хрящ состоит из двух основных компонентов: хондроцитов и внеклеточной матрицы. Хондроциты являются специализированными, метаболически активными клетками, которые играют главную роль в развитии, поддержании и ремонте внеклеточной матрицы4. Гипертрофия хондроцитов (Ch) является одним из основных патологических признаков развития ОА. Он характеризуется увеличением клеточных размеров, снижением протеогликана производства, а также увеличением производства хряща матрицы деградации ферментов, которые в конечном итоге приводят к дегенерации хряща5,6,7. Далее, патологические изменения в подхнольной кости и синовиуме сустава играют важную роль в развитии ОА и прогрессии8,,9,,10,11,12. На сегодняшний день нет существующих лечебных методов лечения, которые подавляют дегенерацию хряща1,,2,,3,,13,,14. Таким образом, существует обширные текущие исследования, направленные на понимание патологии ОА и открыть новые терапевтические подходы, которые способны замедлить или даже остановить ОА. Соответственно, возрастает потребность в количественном и воспроизводимом подходе, который позволяет точно оценить связанные с ОА патологические изменения хряща, синовия и подхноровленной кости сустава.
В настоящее время, ОА тяжести и прогрессии в первую очередь оцениваются с помощью OARSI или Манкин скоринговых систем15. Однако эти системы скоринга являются лишь полуколичественными и могут зависеть от субъективности пользователей. Что еще более важно, они не в состоянии точно оценить тонкие изменения, которые происходят в суставе во время болезни или в ответ на генетические манипуляции или терапевтического вмешательства. Есть спорадические доклады в литературе, описывающие гистоморфометрический анализ хряща, синовия, или подхнольной кости16,17,18,19,20,21. Тем не менее, подробный протокол для строгого и воспроизводимого гистоморфометрического анализа всех этих совместных компонентов по-прежнему отсутствует, создавая неудовлетворенную потребность в этой области.
Для изучения патологических изменений в ОА с помощью гистоморфометрического анализа, мы использовали хирургическую модель мыши ОА, чтобы вызвать ОА через дестабилизацию медиальный мениск (DMM). Среди установленных моделей мурина ОА, DMM был выбран для нашего исследования, поскольку она включает в себя менее травматический механизм травмы22,23,24,25,26. По сравнению с менискаль-связкой травмы (MLI) или передней крестообразной связки травмы (ACLI) операции, DMM способствует более постепенное прогрессирование ОА, подобно развитию ОА у людей22,24,25,26. Мыши были усыплены двенадцать недель после операции DMM для оценки изменений в суставном хряще, подхноловой кости и синовиума.
Целью данного протокола является создание стандартизированного, строгого и количественного подхода к оценке совместных изменений, сопровождающих ОА.
Protocol
Representative Results
Discussion
Недавние исследования остеоартрита улучшили наше понимание перекрестного разговора между различными тканями в суставе и роль каждой ткани играет в инициации болезни или прогрессирования8,9,10,35,36. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы отметить помощь сотрудников Департамента сравнительной медицины и молекулярной и гистопатологии ядро в штате Пенсильвания Милтон С. Херши медицинский центр. Источники финансирования: NIH NIAMS 1RO1AR071968-01A1 (F.K.), ANRF Arthritis Research Grant (F.K.).
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher Chemical | SF100-20 | For sample fixation following harvest |
| Acetic Acid, Glacial (Certified A.C.S.) | Fisher Chemical | A38S-212 | For Decalcification Buffer preparation and acetic acid solution preparation for staining |
| Cintiq 27QHD Creative Pen Display | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Cintiq Ergo stand | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Ethylenediaminetetraacetic acid, tetrasodium salt dihydrate, 99% | Acros Organics | AC446080010 | For Decalcification Buffer preparation |
| Fast Green stain | SIGMA Life Sciences | F7258 | For sample staining |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | For sample section collection |
| HistoPrep Xylene | Fisherbrand | HC-700-1GAL | For sample deparrafinization and staining |
| Histosette II Tissue Cassettes – Combination Lid and Base | Fisher | 15-182-701A | For sample processing and embedding |
| HP Z440 Workstation | HP | Product number: Y5C77US#ABA | For histomorphometric analysis and imaging |
| Manual Rotary Microtome | Leica | RM 2235 | For sample sectioning |
| Marking pens | Leica | 3801880 | For sample labeling, cassettes and slides |
| OLYMPUS BX53 Microscope | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/microscopes/upright/bx53f2/ | For histomorphometric analysis and imaging |
| OLYMPUS DP 73 Microscope Camera | OLYMPUS | https://www.olympus-lifescience.com/en/camera/color/dp73/ | For histomorphometric analysis and imaging (discontinued) |
| ORION STAR A211 pH meter | Thermo Scientific | STARA2110 | For Decalcification Buffer preparation |
| OsteoMeasure Software | OsteoMetrics | https://www.osteometrics.com/index.htm | For histomorphometric measurement and analysis |
| Perfusion Two Automated Pressure Perfusion system | Leica | Model # 39471005 | For mouse knee harvest |
| PRISM 7 Software | GraphPad | Institutional Access Account | Statistical Analysis |
| Safranin-O stain | SIGMA Life Sciences | S8884 | For sample staining |
| ThinkBoneStage – Rotating Microscope Stage | Think Bone Consulting Inc. – OsteoMetrics (supplier) | http://thinkboneconsulting.com/index_files/Slideholder.php | For histomorphometric analysis and imaging |
| Wacom Pro Pen Stylus | Wacom | https://www.wacom.com/en-es/products/pen-displays/cintiq-27-qhd-touch | For histomorphometric analysis and imaging |
| Weigerts Iron Hematoxylin A | Fisher | 5029713 | For hematoxylin staining |
| Weigerts Iron Hematoxylin B | Fisher | 5029714 | For hematoxylin staining |
Referências
- Ma, V. Y., Chan, L., Carruthers, K. J. Incidence, prevalence, costs, and impact on disability of common conditions requiring rehabilitation in the United States: stroke, spinal cord injury, traumatic brain injury, multiple sclerosis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, limb loss, and back pain. Archives of Physical Medicine and Rehabililation. 95 (5), 986-995 (2014).
- Hopman, W., et al. Associations between chronic disease, age and physical and mental health status. Journal of Chronic Diseases in Canada. 29 (3), 108-116 (2009).
- Lorenz, J., Grässel, S., Singh, S., Coppola, V. Experimental osteoarthritis models in mice. Mouse Genetics. Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2004).
- Sophia Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of articular cartilage: structure, composition, and function. Journal of Sports Health. 1 (6), 461-468 (2009).
- Van der Kraan, P., Van den Berg, W. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (3), 223-232 (2012).
- Hodsman, A. B., et al. Parathyroid hormone and teriparatide for the treatment of osteoporosis: a review of the evidence and suggested guidelines for its use. Endocrine Reviews. 26 (5), 688-703 (2005).
- Pitsillides, A. A., Beier, F. Cartilage biology in osteoarthritis-lessons from developmental biology. Nature Reviews Rheumatology. 7 (11), 654 (2011).
- Yuan, X., et al. Bone-cartilage interface crosstalk in osteoarthritis: potential pathways and future therapeutic strategies. Osteoarthritis and Cartilage. 22 (8), 1077-1089 (2014).
- Goldring, S. R., Goldring, M. B. Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nature Reviews Rheumatology. 12 (11), 632 (2016).
- Martel-Pelletier, J., et al. Osteoarthritis. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 16072 (2016).
- Goldring, M. B., Otero, M. Inflammation in osteoarthritis. Current Opinion in Rheumatology. 23 (5), 471 (2011).
- Sellam, J., Berenbaum, F. The role of synovitis in pathophysiology and clinical symptoms of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 6 (11), 625 (2010).
- Ma, H., et al. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (6), 695-700 (2007).
- Katon, W., Lin, E. H., Kroenke, K. The association of depression and anxiety with medical symptom burden in patients with chronic medical illness. General Hospital Psychiatry. 29 (2), 147-155 (2007).
- Glasson, S., Chambers, M., Van Den Berg, W., Little, C. The OARSI histopathology initiative-recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 18, 17-23 (2010).
- Pastoureau, P., Leduc, S., Chomel, A., De Ceuninck, F. Quantitative assessment of articular cartilage and subchondral bone histology in the meniscectomized guinea pig model of osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 11 (6), 412-423 (2003).
- O’Driscoll, S. W., Marx, R. G., Fitzsimmons, J. S., Beaton, D. E. Method for automated cartilage histomorphometry. Tissue Engineering. 5 (1), 13-23 (1999).
- Matsui, H., Shimizu, M., Tsuji, H. Cartilage and subchondral bone interaction in osteoarthrosis of human knee joint: a histological and histomorphometric study. Microscopy Research Technique. 37 (4), 333-342 (1997).
- Hacker, S. A., Healey, R. M., Yoshioka, M., Coutts, R. D. A methodology for the quantitative assessment of articular cartilage histomorphometry. Osteoarthritis and Cartilage. 5 (5), 343-355 (1997).
- Pastoureau, P., Chomel, A., DeCeuninck, F., Sabatini, M., Pastoureau, P. Methods for Cartilage and Subchondral Bone Histomorphometry. Cartilage and Osteoarthritis. Methods in Molecular Medicine. 101, 79-91 (2004).
- McNulty, M. A., et al. A comprehensive histological assessment of osteoarthritis lesions in mice. Cartilage. 2 (4), 354-363 (2011).
- Glasson, S., Blanchet, T., Morris, E. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- Singh, S. R., Coppola, V. . Mouse Genetics: Methods and Protocols. , (2004).
- Fang, H., Beier, F. Mouse models of osteoarthritis: modelling risk factors and assessing outcomes. Nature Reviews Rheumatology. 10 (7), 413 (2014).
- Culley, K. L., Westendorf, J., van Wijnen, A., et al. Mouse Models of Osteoarthritis: Surgical Model of Posttraumatic Osteoarthritis Induced by Destabilization of the Medial Meniscus. Osteoporosis and Osteoarthritis. Methods in Molecular Biology. 1226, 143-173 (2015).
- Van der Kraan, P. Factors that influence outcome in experimental osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage. 25 (3), 369-375 (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Callis, G., Sterchi, D. Decalcification of bone: literature review and practical study of various decalcifying agents. Methods, and their effects on bone histology. Journal of Histotechnology. 21 (1), 49-58 (1998).
- Lajeunesse, D., Massicotte, F., Pelletier, J. P., Martel-Pelletier, J. Subchondral bone sclerosis in osteoarthritis: not just an innocent bystander. Modern Rheumatology. 13 (1), 0007-0014 (2003).
- Li, G., et al. Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes. Arthritis Research Therapy. 15 (6), 223 (2013).
- Kapoor, M., Martel-Pelletier, J., Lajeunesse, D., Pelletier, J. P., Fahmi, H. Role of proinflammatory cytokines in the pathophysiology of osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 33 (2011).
- Scanzello, C. R., Goldring, S. R. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 51 (2), 249-257 (2012).
- Benito, M. J., Veale, D. J., FitzGerald, O., van den Berg, W. B., Bresnihan, B. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (9), 1263-1267 (2005).
- De Lange-Brokaar, B. J., et al. Synovial inflammation, immune cells and their cytokines in osteoarthritis: a review. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (12), 1454-1499 (2012).
- Findlay, D. M., Kuliwaba, J. S. Bone-cartilage crosstalk: a conversation for understanding osteoarthritis. Bone Research. 4, 16028 (2016).
- Lories, R. J., Luyten, F. P. The bone-cartilage unit in osteoarthritis. Nature Reviews Rheumatology. 7 (1), 43 (2011).
- Pritzker, K. P., et al. Osteoarthritis cartilage histopathology: grading and staging. Journal of Osteoarthritis and Cartilage. 14 (1), 13-29 (2006).
- Hayami, T., et al. Characterization of articular cartilage and subchondral bone changes in the rat anterior cruciate ligament transection and meniscectomized models of osteoarthritis. Bone. 38 (2), 234-243 (2006).
- Priemel, M., et al. mineralization defects and vitamin D deficiency: Histomorphometric analysis of iliac crest bone biopsies and circulating 25-hydroxyvitamin D in 675 patients. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (2), 305-312 (2010).
- Yukata, K., et al. Continuous infusion of PTH 1–34 delayed fracture healing in mice. Scientific Reports. 8 (1), 13175 (2018).
- Kawano, T., et al. LIM kinase 1 deficient mice have reduced bone mass. Bone. 52 (1), 70-82 (2013).
- Zhang, L., Chang, M., Beck, C. A., Schwarz, E. M., Boyce, B. F. Analysis of new bone, cartilage, and fibrosis tissue in healing murine allografts using whole slide imaging and a new automated histomorphometric algorithm. Bone Research. 4, 15037 (2016).
- Wu, Q., et al. Induction of an osteoarthritis-like phenotype and degradation of phosphorylated Smad3 by Smurf2 in transgenic mice. Arthritis Rheumatism. 58 (10), 3132-3144 (2008).
- Hordon, L., et al. Trabecular architecture in women and men of similar bone mass with and without vertebral fracture: I. Two-dimensional histology. Bone. 27 (2), 271-276 (2000).
