Summary

Аксональный Транспорт органелл в культурах моторных нейронов с использованием системы микрофлюидных камер

Published: May 05, 2020
doi:

Summary

Аксональный транспорт является важнейшим механизмом для здоровья моторных нейронов. В этом протоколе мы предоставляем подробный метод отслеживания аксональной транспортировки кислых отсеков и митохондрий в моторных нейронных аксонах с помощью микрофлюидных камер.

Abstract

Моторные нейроны (Инн) являются сильно поляризованными клетками с очень длинными аксонами. Аксональный транспорт является важнейшим механизмом для здоровья MN, способствуя росту нейронов, развитию и выживанию. Мы описываем подробный метод использования микрофлюидных камер (МФУ) для отслеживания аксональной транспортировки флуоресцентно маркированных органелл в аксонах MN. Этот метод является быстрым, относительно недорогим, и позволяет для мониторинга внутриклеточных сигналов в пространстве и времени. Мы описываем пошаговый протокол для: 1) Изготовление полидиметилсилоксана (PDMS) МФЦ; 2) Покрытие брюшной спинной мозг explants и MN диссоциированной культуры в МФЦ; 3) Маркировка митохондрий и кислых отсеков с последующим живым конфокальным воображением; 4) Ручной и полуавтоматизированный аксональный анализ транспорта. Наконец, мы демонстрируем разницу в транспортировке митохондрий и кислых отсеков HB9::GFP вентральный спинной мозг explant аксоны как доказательство действия системы. В целом, этот протокол обеспечивает эффективный инструмент для изучения аксонального переноса различных аксональных компонентов, а также упрощенное руководство по использованию MFC, чтобы помочь обнаружить пространственные экспериментальные возможности.

Introduction

MNs являются сильно поляризованными клетками с длинными аксонами, достигающими до одного метра в длину у взрослых людей. Это явление создает критическую проблему для поддержания подключения и функции MN. Следовательно, MNs зависит от надлежащей транспортировки информации, органелл ы и материалов вдоль аксонов от их клеточного тела к синапсу и спине. Различные клеточные компоненты, такие как белки, РНК и органеллы регулярно переносятся через аксоны. Митохондрии являются важными органеллами, которые регулярно транспортируются в MNs. Митохондрии имеют важное значение для надлежащей деятельности и функции MNs, ответственных за предоставление АТФ, буферизации кальция, и сигнализации процессов1,2. Аксональный транспорт митохондрий является хорошо изученным процессом3,,4. Интересно, что дефекты в митохондриальной транспортировки, как сообщается, участвуют в нескольких нейродегенеративных заболеваний и, в частности, в MN заболеваний5. Кислотные отсеки служат еще одним примером для внутренних органелл, которые движутся вдоль аксонов MN. Кислые отсеки включают в себя лисосомы, эндосомы, транс-голги аппарат, и некоторые секреторные пузырьки6. Дефекты в аксональной транспортировки кислых отсеков были обнаружены в нескольких нейродегенеративных заболеваний, а также7, и последние документы подчеркивают их важность в MN заболеваний8.

Для эффективного изучения аксонального транспорта часто используются микрофлюидные камеры, разделяющие соматические и аксональные,10отсеки. Два существенных преимущества микрофлюидной системы, а также разобщенности и изоляции аксонов, делают его идеальным для изучения субклеточных процессов11. Пространственное разделение между нейрональными клетками и аксонами может быть использовано для манипулирования внеклеточной средой различных нейрональных отсеков (например, аксонов против сомы). Биохимические, нейрональный рост / дегенерация, и иммунофлуоресценции анализы все выгоды от этой платформы. МФУ могут также помочь в изучении связи от клетки к клетке путем coculturing нейронов с другими типами клеток, таких как скелетные мышцы12,13,14.

Здесь мы описываем простой, но точный протокол для мониторинга митохондрий и кислого отсека транспорта в моторных нейронов. Мы также показываем использование этого метода, сравнивая относительный процент ретроградных и антероградных движущихся органелл, а также распределение транспортной скорости.

Protocol

Уход и обращение с животными в этом протоколе осуществлялись под наблюдением и одобрением Комитета по этике животных Тель-Авивского университета. 1. Подготовка МФЦ PDMS литья в первичных форм(Рисунок 1) Покупка или создание первичных форм (вафель) ?…

Representative Results

После описанного протокола, мышь эмбриональной HB9::GFP спинного мозга explants были культивированы в MFC(Рисунок 4A). Выращенные растения выращивались в течение 7 дней, когда аксоны полностью пересекались в дистальном отсеке. Mitotracker Deep Red и Lysotracker Red крас…

Discussion

В этом протоколе мы описываем систему отслеживания аксонального переноса митохондрий и кислых отсеков в моторных нейронах. Эта упрощенная платформа in vitro позволяет точно контролировать, контролировать и манипулировать субклеточными нейронными отсеками, позволяя экспериментальный а…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами Израильского научного фонда (ISF, 561/11) и Европейского исследовательского совета (ERC, 309377).

Materials

35mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD35-100
50mm Fluodish – glass bottom dish World Precision Instruments WPI FD5040-100
Andor iXon DU-897 EMCCD camera Andor
ARA-C (Cytosine β-D-arabinofuranoside) Sigma-Aldrich C1768 stock of 2mM in filtered DDW
B-27 Supplement (50X) Thermo Fisher 17504044
BDNF Alomone Labs B-250 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Biopsy punch 1.25mm World Precision Instruments WPI 504530 For preperation of large MFC
Biopsy punch 6mm World Precision Instruments WPI 504533 For preperation of small MFC
Biopsy punch 7mm World Precision Instruments WPI 504534 For preperation of large MFC
Bitplane Imaris software – version 8.4.1 Imaris
Bovine Serum Albumine (BSA) Sigma-Aldrich #A3311-100G 5% w/v in ddw
Chlorotrimetylsilane Sigma-Aldrich #386529-100ML
CNTF Alomone Labs C-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Density Gradient Medium – Optiprep Sigma-Aldrich D1556
Deoxyribonuclease I (DNAse) from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN-25 stock 10mg/mL in neurobasal
Dow Corning High-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA For epoxy mold preperation
DPBS 10X Thermo Fisher #14200-067 dilute 1:10 in ddw
Dumont fine forceps #55 0.05 × 0.02 mm F.S.T 1125520
Epoxy Hardener Trias Chem S.R.L IPE 743 For epoxy mold preperation
Epoxy Resin Trias Chem S.R.L RP 026UV For epoxy mold preperation
FIJI software ImageJ
GDNF Alomone Labs G-240 Dilute to 10 µg/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)
Glutamax 100X Thermo Fisher #35050-038
HB9:GFP mice strain Jackson Laboratories 005029
HBSS 10X Thermo Fisher #14185-045 Dilute 1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter
iQ software Andor
Iris scissors, curved, 10 cm AS Medizintechnik 11-441-10
Iris scissors, straight, 9 cm AS Medizintechnik 11-440-09
Laminin Sigma-Aldrich #L-2020
Leibovitz's L-15 Medium Thermo Fisher 11415064
LysoTracker Red Thermo Fisher L7528
Mitotracker Deep-Red FM Thermo Fisher M22426
Neurobasal medium Thermo Fisher 21103049
Nikon Eclipse Ti micorscope Nikon
Penicillin-Streptomycin (P/S) Solution Biological Industries 03-031-1
Poly-L-Ornithin (PLO) Sigma-Aldrich #P8638 Dilute 1:1000 in flitered 1X PBS
Sylgard 184 silicone elastomer kit DOW Corning Corporation #3097358-1004
Trypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich T1426 stock 25 mg/mL in 1XPBS
Vannas spring microdissection scissors, 3 mm blade F.S.T 15000-00
Yokogawa CSU X-1 Yokogawa

Referências

  1. Misgeld, T., Schwarz, T. L. Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron. 96, 651-666 (2017).
  2. Devine, M. J., Kittler, J. T. Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease. Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).
  3. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).
  4. Mandal, A., Drerup, C. M. Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373 (2019).
  5. Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models. Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).
  6. Anderson, R. G. W., Orci, L. A view of acidic intracellular compartments. Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).
  7. Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration. Current Biology. 28, R471-R486 (2018).
  8. Ya-Cheng Liao, A., et al. RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether. Cell. 179, 147-164 (2019).
  9. Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers. Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).
  10. Gershoni-Emek, N., et al. Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311 (2018).
  11. Neto, E., et al. Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research. Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).
  12. Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance. European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).
  13. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  14. Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ. Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).
  15. Schaller, S., et al. Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).
  16. Ionescu, A., et al. Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model. Cell Death & Disease. 10 (3), 210 (2019).
  17. Zahavi, E. E., et al. A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions. Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).
  18. Maimon, R., et al. Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS. Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).

Play Video

Citar este artigo
Altman, T., Maimon, R., Ionescu, A., Pery, T. G., Perlson, E. Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System. J. Vis. Exp. (159), e60993, doi:10.3791/60993 (2020).

View Video