Summary

Surexpression rétrovirale de CXCR4 sur les cellules murine B-1a et transfert adoptif pour la migration ciblée de cellules B-1a à la moelle osseuse et à la production d’IgM

Published: May 31, 2020
doi:

Summary

Ici, nous décrivons une méthode pour la surexpression rétrovirale et le transfert adoptif des cellules murines B-1a pour examiner in vivo la migration et la localisation de cellules de B-1a. Ce protocole peut être étendu pour divers essais fonctionnels en aval, y compris la quantification de la localisation de cellules B-1a du donneur ou l’analyse des facteurs sécrétés dérivés de cellules de donneurs après le transfert d’adoption.

Abstract

Comme la fonction cellulaire est influencée par des facteurs spécifiques à la niche dans le microenvironnement cellulaire, les méthodes pour disséquer la localisation cellulaire et la migration peuvent fournir un aperçu plus approfondi de la fonction cellulaire. Les cellules B-1a sont un sous-ensemble unique de cellules B chez la souris qui produisent des anticorps IgM naturels protecteurs contre les épitopes spécifiques à l’oxydation qui surviennent pendant la santé et la maladie. La production d’IgM à cellules B-1a diffère selon l’emplacement de la cellule B-1a, et il devient donc utile d’un point de vue thérapeutique de cibler la localisation B-1a à des niches soutenant la production élevée d’anticorps. Ici, nous décrivons une méthode pour cibler la migration de cellules B-1a à la moelle osseuse par surexpression rétrovirale-négociée du récepteur de chimiokine de motif de C-X-C 4 (CXCR4). L’induction génétique dans les cellules B murines primaires peut être difficile et donne généralement de faibles efficacités transfection de 10-20% selon la technique. Ici, nous démontrons que la transduction rétrovirale des cellules B-1a murines primaires entraîne une efficacité de transduction de 30-40%. Cette méthode utilise le transfert cellulaire adoptif des cellules transitoires B-1a dans les souris bénéficiaires déficientes en cellules B afin que la migration et la localisation des cellules B-1a du donneur puissent être visualisées. Ce protocole peut être modifié pour d’autres constructions rétrovirales et peut être utilisé dans divers essais fonctionnels post-transfert adoptif, y compris l’analyse de la cellule du donneur ou du phénotype et de la fonction des cellules hôtes, ou l’analyse des facteurs solubles sécrétés après le transfert cellulaire B-1a. L’utilisation d’allotypes distincts de donneurs et de receveurs différenciés par l’allotype CD45.1 et CD45.2 et la présence d’un journaliste de GFP dans le plasmide rétroviral pourrait également permettre la détection des cellules de donneur dans d’autres modèles murins immunosuffants contenant des populations endogènes de cellules B.

Introduction

Des études récentes ont démontré des cellules immunitaires considérables, et plus particulièrement la cellule B, l’hétérogénéité phénotypique et fonctionnelle selon la localisation cellulaire1,2,3,4,5. Les cellules B-1a sont l’une de ces populations avec la capacité hétérogène de produire des anticorps protecteurs d’IgM ; Les cellules de moelle osseuse B-1a sécrètent IgM de façon constitutive et contribuent de manière significative aux tituses plasmatiques IgM6, tandis que les cellules peritonéal B-1a ont la sécrétion IgM de bas niveau à l’homéostasie et peuvent plutôt être activées par le récepteur inné de type péage (TLR) ou la signalisation cytokine-négociée pour proliférer rapidement, migrer, et sécrétion IgM7,8, 9,9109. Les anticorps IgM à cellules B-1a reconnaissent les épitopes spécifiques à l’oxydation (OSE) qui sont présents sur les agents pathogènes, les cellules apoptotiques et le LDL oxydé, et la liaison IgM à l’OSE peut prévenir la signalisation inflammatoire en aval dans des maladies comme l’athérosclérose11. Par conséquent, les stratégies visant à augmenter la production d’IgM par l’augmentation de la migration péritonéale de cellules B-1a vers des sites comme la moelle osseuse peuvent être thérapeutiquement utiles. Cependant, il est important que de telles stratégies soient ciblées et spécifiques de type cellulaire, car les effets hors cible peuvent avoir un impact négatif sur la fonction ou la santé immunitaires.

Ici, nous décrivons une méthode de surexpression ciblée et à long terme de CXCR4 dans les cellules B-1a murines primaires et le transfert adoptif subséquent pour visualiser la migration cellulaire et la production fonctionnelle d’anticorps IgM (figure 1). La manipulation génétique des cellules B primaires est limitée par une faible efficacité transfection par rapport à la transfection des lignées cellulaires transformées. Cependant, comme les lignées cellulaires transformées peuvent s’écarter considérablement des cellules primaires12,13, l’utilisation de cellules primaires est susceptible de fournir des résultats qui s’alignent plus étroitement à la physiologie normale. Plusieurs techniques ont été décrites pour le transfert de gènes dans les cellules B murines primaires, y compris la transduction rétrovirale, la transduction adénovirale, la lipofection, ou la transfection basée sur l’électroporation, qui ont des niveaux variables d’efficacité, d’éphémère, et d’impact sur la santé cellulaire13,14,15. La méthode suivante a utilisé la transduction rétrovirale car elle a donné une efficacité adéquate de transfert de gène de ‘gt;30% tout en ayant un impact minimal sur la viabilité cellulaire. Le rétrovirus CXCR4-exprimant a été généré à l’aide de la protéine fluorescente ribosomal-verte de la construction rétrovirale décrite précédemment par le virus des cellules souches murines (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, dans lequel la souris CXCR4 gène a été sous-cloné4. Les particules rétrovirales MigR1 (control(Ctl)-GFP) et CXCR4-GFP ont été générées à l’aide de la transfection de phosphate de calcium telle qu’elle a été décrite dans les protocoles4,14précédemment publiés.

Les cellules de B-1a transdurées avec succès ont ensuite été transférées par voie intraveineuse dansrag1-/- souris lymphocytes-déficientes. Les souris de donneur et de destinataire ont en outre contenu le knock-out du gène E (ApoE) d’apolipoprotein, qui a comme conséquence l’accumulation et l’athérosclérose accrues d’OSE, fournissant ainsi un modèle pour l’activation in vivo de cellules B-1 et la production d’IgM. En outre, les souris de donneur et de destinataire différaient dans l’allotype de CD45 ; Les cellules B-1 du donneur provenaient de CD45.1MD ApoE-/- des souris et ont été transférées dans Rag1-/- CD45.2 ApoE-/- receveurs. Ceci a permis la différenciation du CD45.1 de donneur des cellules CD45.2 B destinataire après le transfert sans avoir besoin de tache en outre pour des marqueurs de cellules B pendant l’analyse de cytométrie d’écoulement. Les résultats fournis ici démontrent que la surexpression ciblée de CXCR4 sur les cellules de B-1a associe à la capacité accrue des cellules de B-1a de migrer vers la moelle osseuse, qui associe à l’augmentation de l’anti-OSE IgM plasmatique. Nous fournissons en outre une méthode pour l’enrichissement des cellules péritonéales B-1 par la sélection négative et démontrons l’exigence de l’activation de cellules B-1 pour la transduction efficace. Cette méthode peut être adaptée à d’autres constructions rétrovirales pour étudier l’effet de la surexpression des protéines sur la migration, le phénotype ou la fonction des cellules B-1a. En outre, l’utilisation de CD45.1 contre la distinction d’allotype de CD45.2 pourrait théoriquement permettre le transfert dans d’autres modèles murins immuno-suffisants contenant des cellules B endogènes.

Protocol

Tous les protocoles pour animaux ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Virginie. 1. Séparation magnétique et enrichissement des cellules péritonéales B-1 Euthanasiez une souris de 12 à 14 semaines, mâle,+CD45.1 -ApoE-/- souris utilisant le CO2. Faire une coupe superficielle dans l’abdomen à l’aide de ciseaux chirurgicaux droits et éplucher la peau à l’aide de ciseaux …

Representative Results

Un aperçu du protocole est donné à la figure 1. La figure 2 affiche l’enrichissement des cellules péritonéales B-1a après épuisement magnétique d’autres types de cellules péritonéales. Les cellules de singlet vivantes dans la fraction post-épuisement ont une plus grande proportion de cellules CD19 B par rapport auxmacrophages F4/80, n’ont pas de CD5salut CD19- cellules T, et contiennent une fréquence accrue de c…

Discussion

La méthode fournie ici permet l’administration stable et relativement efficace du gène primaire de cellules B-1a, le transfert adoptif in vivo, et l’identification et la localisation des cellules injectées. Les cellules ont pu être détectées 17 semaines après le transfert de cellules et ont conservé l’expression accrue de CXCR4. La livraison négociée par rétrovirus a donné une efficacité de transduction de 30 à 40 % des cellules B-1a murines primaires ayant un impact minimal sur la viabilité cellulai…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projet 3 de P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara), et R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye a été soutenu par American Heart Association Boursier pré-doctoral 16PRE30300002 et 5T32AI007496-20. Nous remercions Joanne Lannigan, Mike Solga et Claude Chew de l’Université de Virginie Flow Cytometry Core pour leur excellente assistance technique.

Materials

70 micron filter caps Falcon 352235
anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
anti-CD16/CD32, or Fc block Life Technologies MFCR00
B220 APC eBioscience 17-0452-83 Clone: RA3-6B2
Beta-mercaptoethanol Gibco 21985-023
CD19 APCef780 eBioscience 47-0193-82 Clone: eBio1D3
CD23 biotin eBioscience 13-0232-81 Clone: B3B4
CD23 PECy7 eBioscience 25-0232-82 Clone: B3B4
CD3e biotin eBioscience 13-0033-85 Clone: eBio500A2
CD45.1 ApoE-/- mice N/A N/A Bred in house
CD45.1 PerCP-Cy5.5 BD Biosciences 560580 Clone: A20
CD45.2 BV421 BD Biosciences 562895 Clone: 104
CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice N/A N/A Bred in house
CD5 PE eBioscience 12-0051-83 Clone: 53-7.3
Ctl-GFP retrovirus N/A N/A Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender
CXCR4 APC eBioscience 17-9991-82 Clone: 2B11
CXCR4-GFP retrovirus N/A N/A Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid
F4/80 biotin Life Technologies MF48015 Clone: BM8
Flowjo Software v. 9.9.6 Treestar Inc. License required
Gentamicin Gibco 15710-064
Gr-1 biotin eBioscience 13-5931-82 Clone: RB6-8C5
heat-inactivated fetal bovine serum Gibco 16000-044
HEPES Gibco 15630-080
IgM PECF594 BD Biosciences 562565 Clone: R6-60.2
Insulin syringes BD Biosciences 329461
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405
Live/Dead Yellow Life Technologies L34968
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
NK1.1 biotin BD Biosciences 553163 Clone: PK136
Non-essential amino acids Gibco 11140-050
ODN 1668 InvivoGen tlrl-1668
PBS Gibco 14190-144
RPMI-1640 Gibco 11875-093
Sodium pyruvate Gibco 11360-070
Ter119 biotin eBioscience 13-5921-82 Clone: Ter119

Referências

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Citar este artigo
Upadhye, A., Marshall, M., Garmey, J. C., Bender, T. P., McNamara, C. Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production. J. Vis. Exp. (159), e61003, doi:10.3791/61003 (2020).

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