Sobreexpresión retroviral de CXCR4 en células murinas B-1a y transferencia adoptiva para la migración celular B-1a dirigida a la médula ósea y la producción de IgM
Summary
Aquí describimos un método para la sobreexpresión retroviral y la transferencia adoptiva de células murinas B-1a para examinar la migración celular in vivo B-1a y la localización. Este protocolo puede ampliarse para diversos ensayos funcionales posteriores, incluida la cuantificación de la localización celular del donante B-1a o el análisis de factores secretos derivados de células de donantes después de la transferencia adoptiva.
Abstract
Como la función celular está influenciada por factores específicos de nicho en el microambiente celular, los métodos para diseccionar la localización y migración celular pueden proporcionar más información sobre la función celular. Las células B-1a son un subconjunto único de células B en ratones que producen anticuerpos IgM naturales protectores contra epítopos específicos de oxidación que surgen durante la salud y la enfermedad. La producción de IgM de célula b-1a difiere dependiendo de la ubicación de la célula B-1a, y por lo tanto se vuelve útil desde un punto de vista terapéutico para apuntar a la localización B-1a a nichos que apoyan la alta producción de anticuerpos. Aquí describimos un método para apuntar a la migración celular B-1a a la médula ósea mediante sobreexpresión mediada por retroviral del receptor de quimiocina 4 (CXCR4) del motivo C-X-C. La inducción génica en las células murinas primarias B puede ser difícil y normalmente produce bajas eficiencias de transfección de 10-20% dependiendo de la técnica. Aquí demostramos que la transducción retroviral de células murinas primarias B-1a da como resultado una eficiencia de transducción del 30-40%. Este método utiliza la transferencia de células adoptivas de células B-1a transducidas en ratones receptores con deficiencia de células B para que se pueda visualizar la migración y localización de células B-1a del donante. Este protocolo se puede modificar para otras construcciones retrovirales y se puede utilizar en diversos ensayos funcionales después de la transferencia adoptiva, incluyendo el análisis del fenotipo y la función de células de donantes o células huésped, o el análisis de factores solubles secretados después de la transferencia celular B-1a. El uso de ratones donantes y receptores distintos diferenciados por el alotipo CD45.1 y CD45.2 y la presencia de un reportero de GFP dentro del plásmido retroviral también podrían permitir la detección de células donantes en otros modelos de ratón inmunes y inmunes que contienen poblaciones de células B endógenas.
Introduction
Estudios recientes han demostrado células inmunitarias considerables, y específicamente células B, heterogeneidad fenotípica y funcional dependiendo de la localización celular1,2,3,4,5. Las células B-1a son una de esas poblaciones con capacidad heterogénea para producir anticuerpos IgM protectores; Las células B-1a de la médula ósea secretan IgM de forma constitutiva y contribuyen significativamente a los títulos de Plasma IgM6,mientras que las células peritoneales B-1a tienen secreción IgM de bajo nivel en homeostasis y en su lugar se pueden activar a través de receptores innatos similares a peajes (TLR) o señalización mediada con citoquinas para proliferar, migrar y secretar rápidamente IgM7,8,9,10. Los anticuerpos IgM de células B-1a reconocen epítopos específicos de la oxidación (OSE) que están presentes en patógenos, células apoptóticas y LDL oxidado, y la unión igM a OSE puede prevenir la señalización inflamatoria aguas abajo en enfermedades como la aterosclerosis11. Por lo tanto, las estrategias para aumentar la producción de IgM a través del aumento de la migración celular peritoneal B-1a a sitios como la médula ósea pueden ser terapéuticamente útiles. Sin embargo, es importante que tales estrategias sean dirigidas y específicas de tipo celular, ya que los efectos fuera del objetivo pueden afectar negativamente la función inmune o la salud.
Aquí describimos un método para la sobreexpresión dirigida y a largo plazo de CXCR4 en células B-1a murinas primarias y posterior transferencia adoptiva para visualizar la migración celular y la producción funcional de anticuerpos IgM (Figura 1). La manipulación genética de las células B primarias está limitada por una baja eficiencia de transfección en comparación con la transfección de líneas celulares transformadas. Sin embargo, como las líneas celulares transformadas pueden desviarse significativamente de las celdas primarias12,,13, es probable que el uso de células primarias proporcione resultados que se alineen más estrechamente con la fisiología normal. Se han descrito varias técnicas para la transferencia de genes en células B murinas primarias, incluyendo transducción retroviral, transducción adenoviral, lipofección o transfección basada en electroporación, que tienen diferentes niveles de eficiencia, transiencia e impacto en la salud celular13,,14,,15. El siguiente método utilizó la transducción retroviral, ya que produjo una eficiencia adecuada de transferencia de genes de >30%, mientras que afectaba mínimamente a la viabilidad celular. El retrovirus expresivo de CXCR4 se generó utilizando la proteína fluorescente verde verde de entrada de células madre murinas de construcción retroviral anteriormente descrita anteriormente (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, en el que el gen del ratón CXCR4 fue sub-clonado4. Las partículas retrovirales MigR1 (control(Ctl)-GFP) y CXCR4-GFP se generaron utilizando la transfección de fosfato cálcico como se describe en los protocolos publicados anteriormente4,,14.
Las células B-1a transducidas con éxito se transfirieron por vía intravenosa a ratones Rag1-/- con deficiencia de linfocitos. Tanto los ratones donantes como los receptores contenían además la noción del gen Apolipoproteína E (ApoE), lo que resulta en una mayor acumulación de OSE y aterosclerosis, proporcionando así un modelo para la activación celular in vivo B-1 y la producción de IgM. Además, los ratones donantes y receptores diferían en el alostipo CD45; las células de donante B-1 provenían de ratones CD45.1+ ApoE-/- y se transfirieron a receptores Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/-. Esto permitió la diferenciación del donante CD45.1 de las células CD45.2 B receptoras después de la transferencia sin la necesidad de manchar adicionalmente para los marcadores de células B durante el análisis de citometría de flujo. Los resultados proporcionados aquí demuestran que la sobreexpresión de CXCR4 dirigida en células B-1a se asocia con una mayor capacidad de las células B-1a para migrar a la médula ósea, que se asocia con el aumento del plasma anti-OSE IgM. Además, proporcionamos un método para el enriquecimiento de células B-1 peritoneales a través de la selección negativa y demostramos el requisito de activación de la célula B-1 para la transducción eficiente. Este método se puede adaptar para otras construcciones retrovirales para estudiar el efecto de la sobreexpresión de proteínas en la migración celular B-1a, fenotipo o función. Además, el uso de la distinción de alotipo CD45.1 frente a CD45.2 teóricamente podría permitir la transferencia a otros modelos murinos inmunes y suficientes que contengan células B endógenas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método proporcionado aquí permite la administración estable y relativamente eficiente del gen celular B-1a primario, la transferencia adoptiva in vivo y la identificación y localización de las células inyectadas. Las células pudieron ser detectadas 17 semanas después de la transferencia celular y retenían el aumento de la expresión CXCR4. La entrega mediada por retrovirus produjo una eficiencia de transducción del 30-40% de las células B-1a murinas primarias con un impacto mínimo en la viabilidad celular …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Proyecto 3 de P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara), y R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye fue apoyado por la beca predoctoral American Heart Association 16PRE30300002 y 5T32AI007496-20. Agradecemos a Joanne Lannigan, Mike Solga y Claude Chew de la Universidad de Virginia Flow Cytometry Core por su excelente asistencia técnica.
Materials
| 70 micron filter caps | Falcon | 352235 | |
| anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| anti-CD16/CD32, or Fc block | Life Technologies | MFCR00 | |
| B220 APC | eBioscience | 17-0452-83 | Clone: RA3-6B2 |
| Beta-mercaptoethanol | Gibco | 21985-023 | |
| CD19 APCef780 | eBioscience | 47-0193-82 | Clone: eBio1D3 |
| CD23 biotin | eBioscience | 13-0232-81 | Clone: B3B4 |
| CD23 PECy7 | eBioscience | 25-0232-82 | Clone: B3B4 |
| CD3e biotin | eBioscience | 13-0033-85 | Clone: eBio500A2 |
| CD45.1 ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD45.1 PerCP-Cy5.5 | BD Biosciences | 560580 | Clone: A20 |
| CD45.2 BV421 | BD Biosciences | 562895 | Clone: 104 |
| CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice | N/A | N/A | Bred in house |
| CD5 PE | eBioscience | 12-0051-83 | Clone: 53-7.3 |
| Ctl-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender |
| CXCR4 APC | eBioscience | 17-9991-82 | Clone: 2B11 |
| CXCR4-GFP retrovirus | N/A | N/A | Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid |
| F4/80 biotin | Life Technologies | MF48015 | Clone: BM8 |
| Flowjo Software v. 9.9.6 | Treestar Inc. | License required | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Gr-1 biotin | eBioscience | 13-5931-82 | Clone: RB6-8C5 |
| heat-inactivated fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| IgM PECF594 | BD Biosciences | 562565 | Clone: R6-60.2 |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 329461 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | |
| Live/Dead Yellow | Life Technologies | L34968 | |
| LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NK1.1 biotin | BD Biosciences | 553163 | Clone: PK136 |
| Non-essential amino acids | Gibco | 11140-050 | |
| ODN 1668 | InvivoGen | tlrl-1668 | |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360-070 | |
| Ter119 biotin | eBioscience | 13-5921-82 | Clone: Ter119 |
Referências
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